Este estudio describe la caracterización de las propiedades farmacocinéticas (PK) del acetaminofén (APAP) en la plataforma Two-Organ-Chip (2-OC), un dispositivo de dos cámaras capaz de cultivar tejidos 3D bajo flujo. La absorción intestinal y el metabolismo hepático del APAP se emularon mediante equivalentes de intestino e hígado humanos, respectivamente. La barrera intestinal se produjo utilizando células Caco-2 y HT-29. Los esferoides hepáticos se produjeron con células HepaRG y HHSTeC. La viabilidad y la toxicidad de las células se evaluaron mediante el ensayo MTT, la histología, la inmunohistoquímica confocal y el análisis multiparamétrico de alto contenido. La expresión génica de los equivalentes intestinales y hepáticos se evaluó mediante PCR en tiempo real. Se aplicaron tres montajes del Sistema Microfisiológico (MPS): Intestino 2-OC, Hígado 2-OC, e Intestino/Hígado 2-OC. La administración oral se emuló mediante la colocación de APAP sobre el lado apical de la barrera intestinal y las vías intravenosas se imitaron mediante la aplicación en el medio. Las muestras se analizaron por HPLC/UV. El tratamiento con APAP 12 μM o 2 μM no indujo citotoxicidad para la barrera intestinal (punto de tiempo de 24 h) ni para los esferoides de hígado punto de tiempo de 12 h), respectivamente. Todas las preparaciones mostraron una absorción de APAP más lenta que la reportada en humanos: Tiempo máximo (Tmáx) = 12 h para Intestino 2-OC y 6 h para Intestino/Hígado 2-OC tanto en condiciones estáticas como dinámicas, frente a los Tmáx comunicados de 0,33 a 1,4 h tras la administración oral a humanos. El metabolismo del APAP también fue más lento que el reportado en humanos. La vida media de la APAP (T1/2) fue de 12 h en el 2-OC de hígado dinámico, frente a la T1/2 = 2 ± 0,4 h comunicada en humanos. Las muestras tomadas de la preparación estática del Hígado 2-OC no mostraron una disminución de la concentración de APAP. Estos resultados demuestran la capacidad y el potencial del MPS para emular las propiedades de la PK humana y destacan el papel crítico del estímulo mecánico sobre la funcionalidad celular, especialmente al demostrar la clara influencia positiva del flujo microfluídico sobre el rendimiento metabólico de los equivalentes hepáticos.