Cette étude décrit la caractérisation des propriétés pharmacocinétiques (PK) de l’acétaminophène (APAP) dans la plateforme Two-Organ-Chip (2-OC), un dispositif à deux chambres capable de cultiver des tissus 3D sous flux. L’absorption intestinale et le métabolisme hépatique de l’APAP ont été émulés respectivement par des équivalents d’intestin et de foie humains. La barrière intestinale a été produite à l’aide de cellules Caco-2 et HT-29. Les sphéroïdes hépatiques ont été produits avec des cellules HepaRG et HHSTeC. La viabilité et la toxicité des cellules ont été évaluées par le test MTT, l’histologie, l’immunohistochimie confocale et l’analyse multiparamétrique à haut contenu. L’expression génétique des équivalents intestinaux et hépatiques a été évaluée par PCR en temps réel. Trois assemblages du système microphysiologique (MPS) ont été appliqués : Intestin 2-OC, Foie 2-OC, et Intestin/Foie 2-OC. L’administration orale a été imitée par le placement de l’APAP sur le côté apical de la barrière intestinale et les voies intraveineuses ont été imitées par l’application dans le milieu. Les échantillons ont été analysés par HPLC/UV. Le traitement par APAP 12 μM ou 2 μM n’a pas induit de cytotoxicité pour la barrière intestinale (point temporel 24 h) ou pour les sphéroïdes hépatiques point temporel 12 h), respectivement. Toutes les préparations ont montré une absorption de l’APAP plus lente que celle rapportée chez l’homme : Le temps de pic (Tmax) = 12 h pour Intestine 2-OC et 6 h pour Intestine/Liver 2-OC dans des conditions statiques et dynamiques, alors que le Tmax rapporté est de 0,33 à 1,4 h après administration orale chez l’homme. Le métabolisme de l’APAP était également plus lent que celui rapporté chez l’homme. La demi-vie de l’APAP (T1/2) était de 12 h dans le Foie 2-OC dynamique, contre T1/2 = 2 ± 0,4 h rapporté pour les humains. Les échantillons prélevés dans la préparation statique du Foie 2-OC n’ont pas montré de diminution de la concentration d’APAP. Ces résultats montrent la capacité et le potentiel du MPS à émuler les propriétés pharmacocinétiques humaines et soulignent le rôle critique du stimulus mécanique sur la fonctionnalité des cellules, notamment en démontrant l’influence positive claire du flux microfluidique sur la performance métabolique des équivalents hépatiques.