Este estudo descreve a caracterização das propriedades farmacocinéticas (PK) do acetaminofeno (APAP) na plataforma Two-Organ-Chip (2-OC), um dispositivo de duas câmaras capaz de cultivar tecidos 3D sob fluxo. A absorção intestinal de APAP e o metabolismo hepático foram emulados pelo intestino humano e por equivalentes hepáticos, respectivamente. A barreira intestinal foi produzida utilizando células Caco-2 e HT-29. Os esferoides hepáticos foram produzidos com células HepaRG e HHSTeC. A viabilidade e toxicidade celular foram avaliadas pelo ensaio MTT, histologia, imunohistoquímica confocal e análise multiparamétrica de alto conteúdo. A expressão gênica do intestino e equivalentes hepáticos foram avaliados por PCR em tempo real. Três conjuntos de Sistema Microfisiológico (MPS) foram aplicados: Intestino 2-OC, Fígado 2-OC, e Intestino/Fígado 2-OC. A administração oral foi emulada pela colocação de APAP sobre o lado apical da barreira intestinal e as vias intravenosas foram imitadas pela aplicação no meio. As amostras foram analisadas por HPLC/UV. O tratamento com APAP 12 μM ou 2 μM não induziu citotoxicidade para a barreira intestinal (24 h de tempo) ou para os esferoides hepáticos 12 h de tempo), respectivamente. Todas as preparações mostraram absorção de APAP mais lenta do que a relatada para humanos: Tempo de pico (Tmax) = 12 h para Intestino 2-OC e 6 h para Intestino/Fígado 2-OC tanto em condições estáticas como dinâmicas, contra Tmax relatado de 0,33 a 1,4 h após administração oral a humanos. O metabolismo do APAP também foi mais lento do que o relatado para humanos. A meia-vida do APAP (T1/2) foi de 12 h na dinâmica Fígado 2-OC, contra T1/2 = 2 ± 0,4 h relatado para humanos. As amostras retiradas da preparação estática do fígado 2-OC não mostraram diminuição da concentração de APAP. Estes achados mostram a capacidade e o potencial da MPS para imitar as propriedades do PK humano e destacam o papel crítico do estímulo mecânico sobre a funcionalidade celular, especialmente por demonstrar a clara influência positiva do fluxo microfluídico sobre o desempenho metabólico dos equivalentes hepáticos.