This study describes the characterization of pharmacokinetic (PK) properties of acetaminophen (APAP) in the Two-Organ-Chip platform (2-OC), a two-chamber device capable to cultivate 3D tissues under flow. Wchłanianie jelitowe APAP i metabolizm wątrobowy były emulowane odpowiednio przez odpowiedniki ludzkiego jelita i wątroby. Bariera jelitowa została wytworzona przy użyciu komórek Caco-2 i HT-29. Sferoidy wątroby wytworzono z komórek HepaRG i HHSTeC. Żywotność i toksyczność komórek oceniano za pomocą testu MTT, badania histologicznego, immunohistochemii konfokalnej i wieloparametrycznej analizy wysokiej zawartości. Ekspresję genów ekwiwalentów jelitowych i wątrobowych oceniano metodą real-time PCR. Zastosowano trzy zespoły Systemu Mikrofizjologicznego (MPS): Intestine 2-OC, Liver 2-OC, and Intestine/Liver 2-OC. Podanie doustne było naśladowane przez umieszczenie APAP na apikalnej stronie bariery jelitowej, a droga dożylna była naśladowana przez aplikację w medium. Próbki analizowano metodą HPLC/UV. Podanie APAP w dawce 12 μM lub 2 μM nie wywołało cytotoksyczności odpowiednio dla bariery jelitowej (punkt czasowy 24 h) lub dla sferoidów wątroby (punkt czasowy 12 h). Wszystkie preparaty wykazywały wolniejsze wchłanianie APAP niż podawane u ludzi: Szczytowy czas wchłaniania (Tmax) = 12 h dla Intestine 2-OC i 6 h dla Intestine/Liver 2-OC zarówno w warunkach statycznych, jak i dynamicznych, wobec zgłaszanych Tmax wynoszących od 0,33 do 1,4 h po podaniu doustnym u ludzi. Metabolizm APAP był również wolniejszy niż podawany u ludzi. Okres półtrwania APAP (T1/2) wynosił 12 h w dynamicznym Liver 2-OC, w porównaniu z T1/2 = 2 ± 0,4 h podawanym dla ludzi. Próbki pobrane z preparatu statycznego Liver 2-OC nie wykazywały spadku stężenia APAP. Wyniki te pokazują zdolność i potencjał MPS do naśladowania ludzkich właściwości PK i podkreślają krytyczną rolę bodźców mechanicznych w funkcjonalności komórek, szczególnie poprzez wykazanie wyraźnego pozytywnego wpływu przepływu mikroprzepływowego na wydajność metaboliczną odpowiedników wątrobowych.