Results and Discussion
VARV Genome Stability and Phylogenetic Analysis.
Die Verfügbarkeit von Genomsequenzen aus einer Sammlung von VARV-Isolaten mit breiter geographischer Verteilung (Abb. 1) wurde für die evolutionäre Untersuchung von VARV genutzt (4). VARV, ein Mitglied der Gattung Orthopoxvirus, enthält ein einzelnes lineares doppelsträngiges DNA-Genom von 186 kb, das die meisten Enzyme für seine Vermehrung kodiert (5). Die untersuchten VARV-Isolate wiesen eine niedrige Mutationsrate auf, da epidemiologisch verknüpfte Isolate in Proben, deren Entnahmezeitpunkte bis zu einem Jahr auseinander lagen, nur geringe oder keine Sequenzänderungen aufwiesen. Diese niedrige Mutationsrate ist bei unseren genetisch identischen Proben aus Bangladesch, die zwischen 1974 und 1975 gesammelt wurden, deutlich zu erkennen. Diese Proben repräsentieren sicherlich lange, komplexe Übertragungsketten aus einer der am dichtesten besiedelten Regionen der Welt, weisen aber identische oder nahezu identische Nukleotidsequenzen auf. Auch das verwandte Orthopoxvirus monkeypox virus weist bei einem kürzlich in den USA aufgetretenen Ausbruch nur einzelne oder keine Nukleotidänderungen zwischen Isolaten aus drei verschiedenen Wirten auf (6). Innerhalb und zwischen den Arten von Orthopoxviren weisen die Genome Nukleotididentitäten von >99,6 % zwischen VARV-Isolaten und 98 % zwischen VARV und kongenerischen Taxa wie dem Taterapox-Virus (TATV) (4) (Westafrika) und dem Camelpox-Virus (CMLV) (7) (Zentralasien) auf (Tabelle 1), zwei Arten mit der höchsten Sequenzähnlichkeit zu VARV (4). Die große Größe und die langsame Nukleotid-Substitutionsrate ermöglichen es der genomischen VARV-DNA, phylogenetisch informative Mutationen beizubehalten und gleichzeitig die Inzidenz homoplastischer Mutationen (d. h. weniger Umkehrungen des Merkmalszustands) zu verringern. Die Vielfalt der 47 kürzlich sequenzierten VARV-Genome stand weitgehend im Zusammenhang mit der geografischen Herkunft der Isolate (Ref. 4 und diese Studie), und die Mutationen standen nur in geringem Zusammenhang mit der zeitlichen Variation zwischen den Isolaten. Diese Beobachtungen zeigen, dass es keinen einzigen pandemischen Stamm gab (SI-Text, Anmerkung 1), sondern dass die genetischen Kladen dieser Analysen repräsentativ für alte und vielleicht uralte lokal endemische Stämme sind.
Hypothesen über den Ursprung von VARV. Ereignis 0: Die hohe Ähnlichkeit von VARV mit den Genomsequenzen von CMLV und TATV legt nahe, dass TATV und CMLV einen jüngeren gemeinsamen Vorfahren mit VARV haben als andere bekannte Orthopoxvirus-Spezies. Ereignis 1, Hypothese A: Ein Ur-VARV teilte sich in zwei primäre Kladen (P-I und P-II) und entwickelte sich unabhängig in der Alten und Neuen Welt, indem es seinen menschlichen Wirten folgte. Ereignis 1, Hypothese B: Die Divergenz von P-I/P-II in Afrika. Ereignis 2, Hypothese A und B: Der lange einzelne Zweig und die anschließende Radiation von P-I legen nahe, dass das ursprüngliche VARV von P-I wahrscheinlich aus Nordostasien stammt und dass die Pocken-Endemie von P-I begann, sich nach Ostasien, in den Nahen Osten und nach Indien auszubreiten, als die lokalen Populationen groß genug wurden. Ereignis 2a: Die Diversifizierung und Migration von P-I in ganz Asien. Ereignis 2b: Die westliche Erforschung brachte VARV major vom indischen Subkontinent nach Südafrika, das sich dann nordwärts nach Zentralafrika und zum Horn von Afrika (Somali-Halbinsel) ausbreitete. Ereignisse 3 und 4, Hypothese A: Die Diversifizierung von P-II in der Neuen Welt, gefolgt von seiner Wiedereinführung in Afrika; Hypothese B: Die Diversifizierung von P-II in Afrika, gefolgt von der späteren Einführung einer Subklade in die Neue Welt.
Wenn die P-I-Strahlung die endemische Geschichte der Pocken in der Alten Welt darstellt, erklärt dies das historische Rätsel, dass die Pocken in der Literatur der alten griechischen und römischen Zivilisationen nicht beschrieben wurden (1). Es ist wahrscheinlich, dass die Pockenepidemien in dieser Region zu einem späteren Zeitpunkt auftraten als die im alten China und Indien. Die von Thukydides beschriebene „Pestepidemie von Athen“ im Jahr 430 v. Chr., die einst für Pocken gehalten wurde (3), würde dieser Theorie widersprechen, wurde aber kürzlich als Typhus erkannt (25). Während der Herrschaft von Ramses V. befand sich Ägypten in einem Bürgerkrieg und wurde von Feinden aus dem Norden angegriffen (3); wenn der Pustelausbruch von Ramses V. von Pocken herrührte, könnte es sich eher um einen kriegsbedingten Pockenausbruch durch importierte Fälle als um eine regionale endemische Krankheit handeln. Diese Hypothese wird durch die Tatsache gestützt, dass nur drei Mumien aus dieser Zeit ähnliche Läsionen aufwiesen (2).
Diversifizierung von Alastrim minor.
Die auf der Pockengeschichte/VARV-Topologie basierenden Analysen zeigen, dass die Divergenz von Alastrim minor und Westafrikanischer Variola vor mindestens 800 Jahren begann (Tabelle 2 und SI-Tabelle 4), was der früheren Hypothese vorausgeht, dass diese Divergenz mit dem Beginn des Sklavenhandels zusammenfällt. Nach der Hypothese des älteren Ursprungs könnte diese Divergenz nach einem Speziationsereignis entweder in der Neuen Welt (basierend auf der Kalibrierung der frühesten historischen Pockenaufzeichnungen; Abb. 3 A) oder in Westafrika (basierend auf der Kalibrierung der historischen Pockenaufzeichnungen Südafrikas; Abb. 3 B) stattgefunden haben. Diese Szenarien würden darauf hindeuten, dass es nicht identifizierte Variola minor/Alastrim-Isolate gab, die entweder in Afrika oder in der Neuen Welt viel früher als die Entdeckung von Alastrim minor (P-II) existierten; somit hat dieses Taxon eine längere Geschichte als bisher beschrieben.
Obwohl die gut dokumentierte Einschleppung von VARV major nach Amerika verheerende Auswirkungen auf viele der einheimischen Bevölkerungen hatte (2), könnten die Berichte über die rasche Ausbreitung der Krankheit mit hoher Sterblichkeit zum Teil auf die kombinierte Wirkung der hohen Bevölkerungsdichte, der fehlenden Grundversorgung der Opfer und möglicher Koinfektionen mit anderen Krankheiten der Alten Welt zurückzuführen sein (26, 27). Historisch gesehen gibt es nur wenige Aufzeichnungen über Pocken in Westafrika, und Henige (28) argumentierte, dass der erste große VARV-Pockenausbruch in der Neuen Welt nicht aus Westafrika stammte, was die Hypothese einer frühen Pockengeschichte in Westafrika widerlegen würde. Es ist möglich, dass sich Alastrim nach einer früheren Einführung unabhängig in isolierten Regionen innerhalb des großen geografischen Gebiets der Neuen Welt entwickelt hat. Tatsächlich zeigte die Studie von Phelan, dass die einheimischen Populationen im Hochland von Ecuador während der anfänglichen spanischen Herrschaft (die VARV major in die Neue Welt eingeführt haben soll) nicht abnahmen (29), was darauf hindeutet, dass diese Populationen resistenter gegen Pocken gewesen sein könnten, vielleicht durch einen früheren Kontakt mit Alastrim. In Trinidad wurde ein leichter Pockenausbruch im Jahr 1902 dokumentiert, der seinen Ursprung in dieser Region hatte (30). Wenn diese Diversifizierung in der Neuen Welt stattgefunden hat, dann wäre das primäre Isolationsereignis wahrscheinlich auf die Verbringung eines Ur-VARVs mit frühen Menschen in diese Region zurückzuführen (Abb. 4A). Das Fehlen von SNP-Signaturen, die auf eine Vermischung zwischen P-I und P-II hindeuten (SI Abb. 6 und 7), sowie die konsistenten und signifikant unterschiedlichen klinischen Merkmale von Alastrim im Vergleich zum traditionellen VARV major von P-I (31), könnten durch eine solche signifikante geografische Trennung erklärt werden.
Wenn die Aufspaltung von P-I/P-II innerhalb der Alten Welt stattfand, entstand P-II wahrscheinlich in Westafrika. Die beiden P-II-Subkladen hätten sich dann ≈800-1.100 YBP (Tabelle 2 und SI-Tabelle 4) auf dem afrikanischen Kontinent auseinanderentwickelt. Die geografische Verteilung dieser Ereignisse ist schwer zu bestimmen, da es in diesen Regionen keine schriftliche Überlieferung gibt. Das Vorhandensein und die Diversifizierung anderer eng verwandter Orthopoxviren wie Affenpocken und TATV könnte jedoch für einen afrikanischen Ursprung der ursprünglichen VARVs sprechen. Wenn die Isolierung und Diversifizierung von P-II in Afrika stattfand, dann gibt es, basierend auf unserer Phylogenie, einen unbeschriebenen afrikanischen Vertreter der P-II-Subklade, der vielleicht Hunderte von Jahren nach dem Diversifizierungsereignis in die Neue Welt eingeführt wurde, möglicherweise während der Zeit des Sklavenhandels zwischen Ländern in der Alten und Neuen Welt (Abb. 3 B). 3 B).
Ein unzureichendes Verständnis der Geschichte dieser Kulturen und die relativ milderen klinischen Symptome (im Vergleich zu Variola major) tragen dazu bei, dass es keine umfassenderen historischen Aufzeichnungen über Pockenerkrankungen in der Neuen Welt oder in Afrika südlich der Sahara gibt. Die historische Bevölkerungsdichte in diesen beiden Regionen war geringer als in den Regionen mit endemischer Variola major. Bei milderen Krankheitsverläufen wären die Menschen mobiler gewesen, wenn sie sich angesteckt hatten, und hätten eine größere Zahl von Kontakten gehabt und so die Ausbreitung der Krankheit weiter vorangetrieben. Diese Hypothese wird dadurch gestützt, dass die milden Pockenausbrüche in Somalia über lange Zeiträume hinweg in kleinen Nomadengruppen auftraten und ein deutlich anderes Übertragungsmuster aufwiesen als das von VARV major (2). Obwohl nicht bekannt ist, ob die Praxis der Variolation/Impfung von den indigenen Völkern Afrikas oder Amerikas angewandt wurde, würde die Langlebigkeit von VARV im rekonvaleszenten Schorf (bis zu einem Jahrzehnt) (32-34) einen weiteren Mechanismus für die wiederholte Einführung eines Pockenstammes innerhalb einer geografischen Gemeinschaft bieten, entweder durch unbeabsichtigten Kontakt mit Schorfmaterial oder direkt durch Variolationspraktiken.
Herkunft von VARV.
Mögliche Hinweise auf die Anpassung von VARV an den Menschen finden sich in der engen Beziehung zwischen VARV und TATV/CMLV (4). TATV ist mit einem in Westafrika beheimateten terrestrischen Nagetier assoziiert (35). Unsere Koaleszenzanalysen zeigen, dass die Divergenz zwischen VARV und TATV zwischen 16.000 YBP (Tabelle 2 und SI-Datensatz 4, basierend auf den historischen Pockenaufzeichnungen in Südafrika) und 68.000 YBP (Tabelle 2 und SI-Datensatz 3, basierend auf der frühesten aufgezeichneten Pockengeschichte in Ostasien) liegt. Wie die verwandten zoonotischen Orthopoxviren mit Nagetierreservoiren (6, 36, 37) könnte sich VARV also aus einem enzootischen Erreger afrikanischer Nagetiere entwickelt und sich anschließend aus Afrika heraus ausgebreitet haben.
Die für diese Studie ausgewählten genomischen Sequenzen der VARV-Isolate stammen aus dem Repository des World Health Organization Collaborating Center und sind trotz ihrer geringen Sequenzdivergenz repräsentativ für die größte geografische und zeitliche Vielfalt innerhalb der Sammlung. Die aus den cSNP abgeleitete Phylogenie dieser Isolate ergibt eine Topologie, die mit historischen menschlichen Migrationsmustern, Bevölkerungsexpansion und dokumentierten Pockenepidemien übereinstimmt. Die dargestellte Topologie stützt die Hypothese (Abb. 3), dass sich zwei Kladen von Variola von einem Urvirus abzweigten und sich anschließend in geografisch getrennten menschlichen Populationen entwickelten. Obwohl der Grund für die unterschiedliche Pathogenese von alastrim und VARV major beim Menschen unklar ist, fügen die genetische Struktur von alastrim minor und seine Topologie mit den anderen VARV-Isolaten dem Pocken-Evolutionspuzzle entscheidende Teile hinzu. Diese vorgeschlagene Phylogenie von VARV erweitert die Evolutionszeit der Pocken im Vergleich zu früheren Theorien.