Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ist eine Form der Säulenchromatographie, bei der ein Probengemisch oder ein Analyt in einem Lösungsmittel (der so genannten mobilen Phase) unter hohem Druck durch eine Säule mit chromatographischem Füllmaterial (stationäre Phase) gepumpt wird. Die Probe wird von einem sich bewegenden Trägergasstrom aus Helium oder Stickstoff mitgeführt. Die HPLC ermöglicht die Trennung und Identifizierung von Verbindungen, die in jeder Probe, die in einer Flüssigkeit gelöst sein kann, in Spurenkonzentrationen bis hin zu Teilen pro Billion vorhanden sind. Aufgrund dieser Vielseitigkeit wird die HPLC in einer Vielzahl von industriellen und wissenschaftlichen Anwendungen eingesetzt, z. B. in der Pharmazie, im Umweltbereich, in der Forensik und in der Chemie.

Die Retentionszeit einer Probe hängt von der Wechselwirkung zwischen der stationären Phase, den zu analysierenden Molekülen und dem oder den verwendeten Lösungsmitteln ab. Während die Probe die Säule durchläuft, interagiert sie zwischen den beiden Phasen unterschiedlich schnell, was in erster Linie auf die unterschiedlichen Polaritäten der Analyten zurückzuführen ist. Analyten, die die geringste Wechselwirkung mit der stationären Phase oder die stärkste Wechselwirkung mit der mobilen Phase haben, verlassen die Säule schneller.

Instrumentierung:
Zu den Hauptkomponenten eines HPLC-Systems gehören der Lösungsmittelbehälter oder mehrere Behälter, eine Hochdruckpumpe, eine Säule, ein Injektorsystem und der Detektor.

Das Reservoir enthält das Lösungsmittel, das als mobile Phase bezeichnet wird, weil es sich bewegt. In der Regel gibt es mindestens zwei Behälter in einem System, die jeweils bis zu 1000 cm³ Lösungsmittel enthalten und in der Regel mit einem Gasdiffusor ausgestattet sind, durch den Helium eingeblasen werden kann. Eine Pumpe wird verwendet, um einen bestimmten Fluss der mobilen Phase zu erzeugen. Die Injektion von Proben kann zwar immer noch von Hand erfolgen, doch die meisten HPLC-Geräte sind heute vollautomatisch und werden von einem Computer gesteuert. Der Injektor oder Auto-Sampler führt das Lösungsmittel in einen Phasenstrom ein, der die Probe in die unter hohem Druck (bis zu 400 bar) stehende Säule leitet, die spezielles Füllmaterial enthält, das für die Trennung benötigt wird. Das Packungsmaterial wird als stationäre Phase bezeichnet, da es von der Säulenhardware festgehalten wird.
Ein Detektor wird benötigt, um die getrennten Verbindungsbanden zu sehen, wenn sie aus der Hochdruck-Säule eluieren. Die Informationen werden vom Detektor an einen Computer gesendet, der das Chromatogramm erstellt. Die mobile Phase verlässt den Detektor und wird je nach Wunsch entweder in den Abfall geleitet oder aufgefangen.

Das Einblasen von Helium ist eine wirksame Methode zur Entgasung der mobilen Phase, um instabile Basislinien zu vermeiden, die durch gelöste Luft verursacht werden. Stickstoff wird als Vernebelungsgas in Verdunstungs-Lichtstreudetektoren (ELSD) verwendet, bei denen das Lösungsmittel aus der Probe verdampft wird und einen Nebel hinterlässt, der gemessen wird.

Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie – andere HPLC-Typen

Ultra-Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (uHPLC):
Während bei der Standard-HPLC in der Regel Säulenpartikel mit einer Größe von 3 bis 5 µm und einem Druck von etwa 400 bar verwendet werden, werden bei der uHPLC speziell entwickelte Säulen mit Partikeln von bis zu 1,7 µm Größe bei einem Druck von über 1000 bar eingesetzt. Der Hauptvorteil einer uHPLC ist die Geschwindigkeit. Diese Systeme sind schneller, empfindlicher und benötigen geringere Mengen an organischen Lösungsmitteln als die Standard-HPLC, so dass mehr Proben in kürzerer Zeit untersucht werden können. Werden die Systeme jedoch bei einem typischen Druck von mehr als 800 bar betrieben, altern die Säulen bzw. bauen sich schneller ab. Für uHPLC-Geräte wird eine neuere Technologie entwickelt, die Säulenpartikel mit einer Größe von 1 µm und einem Druckpotenzial von bis zu 6.800 bar verwendet.
uHPLC ist auch als UPLCTM bekannt, eine Marke der Waters Corporation.
Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC):
FPLC ist ein der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ähnliches System, das zur Trennung oder Reinigung von Proteinen und anderen Biomolekülen aus komplexen Gemischen verwendet wird. Der Hauptunterschied zwischen FPLC und HPLC ist der Standardarbeitsdruck. FPLC-Säulen können nur bis zu einem maximalen Druck von 3-5 MPa verwendet werden. Wenn der Druck der HPLC begrenzt werden kann, kann fast jede FPLC-Säule auch in einem HPLC-System verwendet werden.