Dosis- und Zeiteffekte der Koffeinaufnahme auf die Adenosin-A2A-Rezeptoren der menschlichen Blutplättchen

Koffein, das in verschiedenen Quellen wie Kaffee, Tee, Schokolade und Cola-Getränken vorkommt, ist die am weitesten verbreitete aktive Substanz der Welt. Der durchschnittliche Koffeinkonsum erwachsener Menschen schwankt je nach Kultur und Land zwischen 80 und 400 mg pro Person und Tag.1 Koffein löst eine Vielzahl pharmakologischer Reaktionen aus, darunter eine erhöhte Vigilanz, eine verringerte psychomotorische Reaktionszeit sowie eine verlängerte Schlaf- und Wachzeit, und kann auch die intellektuelle Leistungsfähigkeit beeinflussen.2 Darüber hinaus bewirkt Koffein eine Entspannung der glatten Muskulatur, steigert die Magensäuresekretion und die Freisetzung von Katecholaminen und erhöht die Stoffwechselaktivität.3

Die genauen Mechanismen, die den Wirkungen von Koffein zugrunde liegen, sind nach wie vor unklar. Obwohl die Hemmung von Phosphodiesterasen zu den Wirkungen von Koffein beitragen kann,4 gibt es immer mehr Hinweise darauf, dass die meisten pharmakologischen Wirkungen dieses Xanthins aus dem Antagonismus von Adenosinrezeptoren resultieren, die als A1-, A2A-, A2B- und A3-Subtypen bezeichnet werden.5 Koffein wirkt am stärksten an A2A-Rezeptoren, dicht gefolgt von A1-Rezeptoren, dann A2B-Rezeptoren,6 und als schwacher Antagonist an menschlichen A3-Rezeptoren. Die Blockade von Adenosinrezeptoren, insbesondere der A1- und A2A-Rezeptortypen, durch Koffein hemmt die Wirkung von endogenem Adenosin auf eine Vielzahl physiologischer Prozesse.7 Unter normalen Bedingungen scheinen die Adenosinspiegel im Blut ausreichend zu sein, um A2A-Rezeptoren in Blutplättchen tonisch zu aktivieren. Kürzlich wurde berichtet, dass bei Mäusen mit A2A-Rezeptor-Knockout die Thrombozytenaggregation erhöht war, was auf die Bedeutung dieses Rezeptorsubtyps für die Thrombozytenfunktion hinweist.8 Es ist daher denkbar, dass Koffein diese tonisch aktivierten A2A-Rezeptoren in Thrombozyten blockieren und ihre durch Adenosin modulierten Funktionen verändern könnte.

Seit vielen Jahren wird ein Zusammenhang zwischen Kaffeekonsum und kardiovaskulären Erkrankungen, insbesondere der koronaren Herzkrankheit, vermutet,9 in jüngster Zeit wurde jedoch nachgewiesen, dass Kaffee- oder Koffeinkonsum das Risiko für koronare Herzerkrankungen oder Schlaganfälle nicht erhöht.1011 Zahlreiche epidemiologische Studien, die sich mit dem Thema Herzinfarkt befassen, haben keine schädliche Wirkung von <5 Tassen Kaffee pro Tag festgestellt, während die Ergebnisse bei höherem Kaffeekonsum umstritten sind.12 Bei Patienten mit Bluthochdruck wurde bei keinem Niveau des Koffeinkonsums ein negatives Ergebnisrisiko beobachtet.13

In einer Studie von Biaggioni et al.14 wurde festgestellt, dass eine wiederholte Koffeineinnahme bei menschlichen Blutplättchen zu signifikanten Veränderungen der funktionellen Reaktionen auf den Adenosinrezeptor-Agonisten 5′-N-Ethylcarboxamidoadenosin (NECA) führt. Der Entzug von Koffein führte zu einer deutlichen Linksverschiebung der NECA-induzierten Aggregationshemmung.14 In Übereinstimmung damit haben wir vor kurzem bei Probanden, die eine Woche lang mit 750 mg/Tag behandelt wurden,15 gezeigt, dass die chronische Einnahme von Koffein die Thrombozytenaggregationsfähigkeit infolge einer Hochregulierung der A2A-Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche verändert.

Im vorliegenden Artikel liefern wir weitere Belege dafür, dass eine ähnliche Reaktion bei Probanden auftritt, die über einen längeren Zeitraum, z. B. zwei Wochen, mit verschiedenen Koffein-Dosen, wie 600 mg/Tag für eine Woche oder 400 mg/Tag, behandelt wurden. In der vorliegenden Studie wurden die Veränderungen der Adenosin-A2A-Rezeptoren (Dichte und Affinität) und ihre Funktion direkt gemessen, indem die Wirkung des selektiven A2A-Agonisten 2-Hexynyl-NECA (HE-NECA) auf (1) die Erhöhung der cAMP-Akkumulation, (2) die Hemmung der Thrombozytenaggregation und (3) die Senkung des intrazellulären Kalziumspiegels bestimmt wurde. Nach chronischem Konsum (600 mg/Tag für 1 Woche oder 400 mg/Tag für 2 Wochen) wurde eine Hochregulierung der Adenosin-A2A-Rezeptoren der Blutplättchen festgestellt, die in hohem Maße mit antiaggregatorischen Effekten, einem Anstieg der cAMP-Akkumulation und einem Rückgang des intrazellulären Kalziumspiegels korreliert war. Es wurden keine Unterschiede bei den Bindungs- und Funktionsparametern von Probanden festgestellt, die 1 Woche lang mit 400 mg/d behandelt wurden.

Methoden

Fünfundvierzig gesunde, nicht rauchende Probanden beider Geschlechter im Alter von 25 bis 45 Jahren wurden untersucht. Nach einer schriftlichen Einverständniserklärung wurden die Probanden gebeten, ≥2 Wochen lang auf Methylxanthine in der Nahrung zu verzichten. Die Probanden wurden je nach Verabreichungsschema (d. h. Dosis und Dauer der Verabreichung) in drei Gruppen (je 15 Personen) eingeteilt: 200 mg Koffein 2-mal täglich oral über einen Zeitraum von 7 Tagen (Gruppe 1), 200 mg 2-mal täglich oral über einen Zeitraum von 14 Tagen (Gruppe 2) und 200 mg 3-mal täglich oral über einen Zeitraum von 7 Tagen (Gruppe 3). Die Blutplättchen dieser Probanden wurden untersucht, bevor sie mit Koffein begannen (Tag 0) und 1, 12, 60 und 108 Stunden nach der letzten Koffeineinnahme. Insbesondere wurde der 1-Stunden-Zeitpunkt nur in der Gruppe untersucht, die die höchste Koffein-Dosis (600 mg/d) erhielt. Die EC50- und IC50-Werte in funktionellen Assays konnten wegen der praktischen Probleme, die mit der übermäßigen Blutentnahme in einem engen Zeitraum (1 bis 12 Stunden) verbunden sind, nicht nach 1 Stunde ermittelt werden.

SCH 58261 Bindungsassay in humanen Thrombozytenmembranen

Membranen aus humanen Thrombozyten wurden wie zuvor beschrieben16 hergestellt und für Radioliganden-Bindungsassays mit SCH 58261 gemäß Varani et al.17 verwendet. In Sättigungsstudien wurden menschliche Thrombozytenmembranen mit 8 bis 10 verschiedenen Konzentrationen von SCH 58261 im Bereich von 0,01 bis 10 nmol/L inkubiert. Die unspezifische Bindung wurde in Gegenwart von NECA 10 μmol/L bestimmt. Nach 60 Minuten Inkubation bei 4°C wurden die Proben durch Whatman GF/B-Filter mit einem Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co) filtriert. Für die Computeranalyse der Daten aus den Sättigungsexperimenten wurde ein gewichtetes nichtlineares Programm zur Kurvenanpassung (LIGAND)18 verwendet.

Messung des cAMP-Spiegels in menschlichen Thrombozyten

Gewaschene menschliche Thrombozyten aus dem peripheren Blut gesunder Probanden wurden wie zuvor beschrieben hergestellt.16 Thrombozyten (6×104 bis 8×104 Zellen) wurden mit 1,0 U Adenosindesaminase/ml, 0,5 mmol/L 4-(3-Butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidazolidinon (Ro 20-1724) als Phosphodiesteraseinhibitor und 6 bis 8 verschiedenen Konzentrationen von HE-NECA inkubiert. Die EC50-Werte wurden aus Konzentrations-Wirkungs-Kurven nach log-logit-Transformation der abhängigen Variablen durch eine gewichtete Methode der kleinsten Quadrate ermittelt.19 Die endgültige wässrige Lösung wurde mit einem Wettbewerbsprotein-Bindungstest auf den cAMP-Gehalt getestet.15

Thrombozytenaggregations-Assay

Citriertes menschliches Blut wurde 10 Minuten lang bei 200 g zentrifugiert, um plättchenreiches Plasma zu erhalten, und 20 Minuten lang bei 2500 g, um plättchenarmes Plasma zu erhalten. Die menschlichen Blutplättchen wurden in einem Coulter-Zählgerät, Modell S8/80 (Coulter Electronics Inc), gezählt und mit autologem plättchenarmen Plasma auf 2,5×108/ml bis 3,5×108/ml eingestellt. Die Thrombozytenaggregation wurde nach dem Born-Turbidimetrieverfahren20 mit einem DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co) durchgeführt. Nach dreiminütiger Inkubation mit 6 bis 8 verschiedenen Konzentrationen von HE-NECA wurde plättchenreiches Plasma bei 37 °C unter ständigem Rühren mit ADP aggregiert. Ähnliche Versuche wurden mit ADP in verschiedenen Konzentrationen (100 nmol/L bis 100 μmol/L) durchgeführt. Die maximale Aggregation, die 5 Minuten nach der Zugabe von ADP gemessen wurde, wurde für die quantitative Analyse verwendet, und der Prozentsatz der Hemmung wurde im Verhältnis zu den Kontrollwerten berechnet.21

Messungen der Konzentration von freiem Ca2+ im Zytoplasma

Die Konzentration von freiem Kalzium im Zytoplasma wurde mit Hilfe der Fura-2-Technik nach Paul et al.22 gemessen. Kurz gesagt, wurden Thrombozyten in völliger Dunkelheit für 30 Minuten bei 37°C mit 1 μmol/L fura 2-AM inkubiert und in Fluorimeterküvetten (LS50, Perkin Elmer, Ltd) in einer Konzentration von 108/mL in Gegenwart von 250 μmol/L Sulfinpyrazon magnetisch gerührt. Die intrazelluläre Ca2+-Konzentration (i) wurde bei einem Anregungsverhältnis von 340/380 und einer Emissionswellenlänge von 505 nm bestimmt.

Statistische Analyse

Die Analyse der Daten wurde mittels 1-Wege-ANOVA durchgeführt. Die Analyse der Unterschiede zwischen den mit Koffein behandelten Gruppen (12, 60 und 108 Stunden) und den Kontrollpersonen wurde mit dem Student’s t-Test (ungepaarte Analyse) durchgeführt. Unterschiede wurden bei einem Wert von P<0,01 als signifikant angesehen. Alle Daten sind als Mittelwert±SEM angegeben.

Ergebnisse

Die Blutplättchen der drei Probandengruppen wurden vor Beginn der Koffeinverabreichung (Tag 0, Kontrolle) und 1, 12, 60 und 108 Stunden nach der letzten Dosis (Koffeinentzug) entnommen. Die Tabelle fasst die Ergebnisse der Bindungs- und Funktionsexperimente der drei Probandengruppen zusammen.

Gruppe 1 (400 mg/d für 1 Woche)

Die Bindungsparameter ergaben einen Kontroll-Bmax-Wert von 105±6 fmol/mg Protein und einen KD-Wert von 1,28±0,08 nmol/L. In Kontrollplättchen erhöhte HE-NECA den cAMP-Spiegel mit einer EC50 von 60±5 nmol/L und hemmte (1) die Aggregation mit einer IC50 von 86±10 nmol/L und (2) den Kalziumspiegel mit einer IC50 von 104±8 nmol/L. Es wurden keine statistisch signifikanten Unterschiede bei den Bindungs- und Funktionsparametern 12, 60 und 108 Stunden nach dem Koffeinentzug festgestellt (Tabelle).

Gruppe 2 (400 mg/d für 2 Wochen)

Bindungsparameter ergaben einen Kontroll-Bmax-Wert von 110±3 fmol/mg Protein und einen KD-Wert von 1,21±0,09 nmol/L. 12 und 60 Stunden nach dem Koffeinentzug stiegen die Rezeptordichten, Bmax, zu beiden Zeitpunkten um etwa 20 %, die KD-Werte blieben jedoch unverändert. Funktionelle Experimente zeigten, dass der Adenosin-A2A-Rezeptor-Agonist HE-NECA das cAMP der Thrombozyten signifikant stärker erhöhte (d. h. die EC50-Werte waren 12 bzw. 60 Stunden nach dem Koffeinentzug um 45 % bzw. 65 % niedriger als die Kontrollwerte). Ein ähnlicher Trend wurde bei den IC50-Werten beobachtet, die in Aggregationsexperimenten und bei Messungen der zytoplasmatischen freien Kalziumkonzentration ermittelt wurden (Tabelle).

Gruppe 3 (600 mg/d für 1 Woche)

Insgesamt erhielten wir ähnliche Daten wie in Gruppe 2. SCH 58261 band an eine einzige Affinitätsklasse von Stellen in Thrombozytenmembranen von Kontrollen mit einer Bmax von 100±4 fmol/mg Protein und einer KD von 1,27±0,09 nmol/L. Wie in Abbildung 1A dargestellt, wurde der Radioligand in Membranen von Thrombozyten, die 1, 12, 60 und 108 Stunden nach dem Koffeinentzug geerntet wurden, mit der gleichen Affinität gebunden, aber die Anzahl der Bindungsstellen (Bmax) war signifikant (P<0,01) erhöht. In parallelen Studien wurden die funktionellen Reaktionen von Thrombozyten auf den A2A-Rezeptor-Agonisten HE-NECA bestimmt. Wie in der Tabelle zusammengefasst, war die Fähigkeit von HE-NECA, (1) die cAMP-Bildung zu erhöhen, (2) die ADP-induzierte Thrombozytenaggregation zu hemmen und (3) den Kalziumspiegel zu senken, bei Thrombozyten, die 12, 60 und 108 Stunden nach Koffeinentzug gewonnen wurden, signifikant erhöht (Abbildung 1B, 1C und 1D). Es wurden auch Experimente durchgeführt, um festzustellen, ob die Zunahme der Dichte der A2A-Rezeptoren mit einer Abnahme der Wirksamkeit und/oder Effizienz von ADP zur Auslösung der Aggregation einhergeht. Die EC50-Werte von ADP zur Stimulierung der Thrombozytenaggregation 12, 60 und 108 Stunden nach Koffeinentzug betrugen 0,7±0,2, 0,9±0,1 bzw. 0,8±0,1 μmol/L, Werte, die sich nicht signifikant von den 0,9±0.2 μmol/L, die in Thrombozyten von Kontrollen erhalten wurden (Abbildung 2).

Diskussion

Die Auswirkungen einer langfristigen Verabreichung von Koffein bei Menschen und Tieren und seine Rolle bei der Toleranz gegenüber den Wirkungen von Koffein sind umstritten. Einige Studien, die einen Anstieg der A1-Rezeptoren im Gehirn von Mäusen zeigten, wiesen auf eine dosisabhängige Hochregulierung der A1-Rezeptoren durch Koffein hin.23 Andere Studien ergaben eine Hochregulierung der A2A-Rezeptoren, was auf eine adaptive Wirkung der Koffeinaufnahme hindeutet.24 Darüber hinaus kann chronischer Koffeinkonsum zu einer Verringerung der Thrombozytenaggregierbarkeit führen, die auf eine Hochregulierung der A2A-Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche14 zurückzuführen ist, die eine potenzielle Rolle bei pathophysiologischen Prozessen wie Aggregation und Thrombogenese spielt. Obwohl solche Veränderungen zu einer veränderten Thrombozytenfunktion beitragen können, verändert die Toleranz gegenüber Koffein nicht die Wirksamkeit dieses Xanthins als kompetitiver Antagonist der Adenosinwirkung.25 Andere Veränderungen, wie die Verschiebung der Rezeptoraffinität in einen hochaffinen Zustand, Veränderungen der G-Protein-Spiegel oder der Kopplung dieser Proteine an die Adenosinrezeptoren oder eine langfristige Rezeptorbelegung, können an dem Phänomen der Toleranz beteiligt sein.26 Beim Menschen treten Entzugserscheinungen von Koffein auf; typischerweise handelt es sich dabei um Kopfschmerzen, Müdigkeit, Apathie und Schläfrigkeit.9 Insbesondere erhöht Koffein die Adenosinkonzentration im Plasma, und ihre Verringerung nach dem Entzug des Antagonisten deutet auf eine rezeptorvermittelte Regulierung der Adenosinkonzentration im Plasma hin.27 Während Ischämie und/oder Hypoxie hat Adenosin auch neuroprotektive Wirkungen. Im erwachsenen Gehirn reduziert eine chronische Koffeinbehandlung, die zu einer Hochregulierung der Adenosinrezeptoren führt, die ischämischen Schäden, während eine akute Exposition (rezeptorantagonistische Wirkung) die ischämischen Schäden erhöht.28

Es wurde nachgewiesen, dass die chronische Einnahme von Koffein die Reaktion der Blutplättchen auf die Wirkung von Adenosin verändert.14 Die wiederholte Verabreichung von Koffein (750 mg/Tag für eine Woche) führte zu einer Erhöhung der A2A-Rezeptordichte, begleitet von einer Sensibilisierung der Thrombozytenreaktionen, wie z. B. einer Zunahme der cAMP-Akkumulation und einer Abnahme der Thrombozytenaggregation.15 Ziel der vorliegenden Studie war es, die Auswirkungen der Koffein-Dosierung und der Dauer der Verabreichung auf die Bindungs- und Funktionsparameter zu bestimmen. Daher untersuchten wir die Veränderungen der Dichte und Affinität von Adenosin-A2A-Rezeptoren in den Membranen menschlicher Thrombozyten von Probanden, die mit unterschiedlichen Dosen (400 oder 600 mg/d) über unterschiedliche Zeiträume der Koffeineinnahme (1 oder 2 Wochen) behandelt wurden. Im Einzelnen untersuchten wir Kontrollpersonen (vor der Verabreichung von Koffein) und mit Koffein behandelte Personen (1, 12, 60 und 108 Stunden nach der letzten Koffeindosis).

Die Behandlung mit 400 mg/Tag Koffein für eine Woche veränderte die A2A-Rezeptorbindung und die funktionellen Parameter nicht. Die Behandlung mit 400 mg/d für 2 Wochen oder 600 mg/d für 1 Woche führte jedoch zu (1) einem signifikanten Anstieg (Hochregulierung) der Adenosin-A2A-Bindungsstellen, (2) einem Anstieg der cAMP-Akkumulation, (3) einem Anstieg der antiaggregatorischen Effekte und (4) einem Rückgang der Kalziumwerte, die durch den A2A-Rezeptor-Agonisten HE-NECA ausgelöst wurden.

Die Hochregulierung der A2A-Rezeptoren kann wahrscheinlich auf die Synthese neuer Rezeptoren während der Differenzierung der Vorläuferzellen zurückgeführt werden. Diese Interpretation stützt sich auf die Ergebnisse von In-vitro-Experimenten, die zeigen, dass die Inkubation von plättchenreichem Plasma von Kontrollpersonen über einen Zeitraum von 6 oder 12 Stunden mit Koffein oder SCH 58261 keinen Einfluss auf die Bindungsparameter hatte.15 Die durch die chronische Einnahme von Koffein verursachte Hochregulierung der Adenosin-A2A-Rezeptoren könnte als Hinweis darauf interpretiert werden, dass endogenes Adenosin einen tonischen Einfluss auf die menschlichen Blutplättchen hat und die Anwesenheit des Antagonisten durch die Hochregulierung der A2A-Rezeptoren ausgeglichen wird. Bei Erwachsenen wird Koffein effizient aus dem Gastrointestinaltrakt resorbiert; die höchsten Plasmakonzentrationen treten 15 bis 120 Minuten nach der Einnahme auf, und die Halbwertszeit von Koffein beträgt 2,5 bis 4,5 Stunden.7 Der Anstieg der Adenosin-A2A-Rezeptoren, der eine Stunde nach der letzten Koffeindosis festgestellt wurde, war mit demjenigen vergleichbar, der 12 oder 60 Stunden nach dem Koffeinentzug festgestellt wurde, was zeigt, dass der Entzug für die Hochregulierung der A2A-Rezeptoren nicht notwendig war.

Ein weiteres Ziel der vorliegenden Studie war es, festzustellen, ob die Änderungen der Bindungsparameter mit Änderungen der funktionellen Reaktion(en) korrelierten. Es wurde festgestellt, dass die Thrombozytenaggregation mit einer Aktivierung der Adenylatzyklase und einem Anstieg der intrazellulären Kalziumkonzentration verbunden war. Die Wirksamkeit von HE-NECA war 12, 60 und 108 Stunden nach Koffeinentzug im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die wiederholte Verabreichung verschiedener Koffein-Dosen zu signifikanten Veränderungen in der Anzahl der A2A-Rezeptoren auf der Thrombozytenoberfläche führt, begleitet von einer erhöhten Ansprechbarkeit auf die Rezeptorstimulation. Der klassische Adenosin-A2A-Rezeptor ist für die antiaggregatorischen Eigenschaften von Adenosin und seinen Analoga verantwortlich, was mit der Beobachtung übereinstimmt, dass die Aggregation bei Mäusen, denen die A2A-Rezeptoren fehlen, effizienter ist.8 Die durch steigende ADP-Konzentrationen ausgelöste Thrombozytenaggregation unterschied sich jedoch nicht signifikant zwischen den Kontrollpersonen und den mit Koffein behandelten Personen. Eine mögliche Erklärung für die letztgenannte Beobachtung ist, dass nicht genügend Adenosin im Testmedium vorhanden ist, um eine Reaktion hervorzurufen. Oder das Ausmaß der Rezeptor-Hochregulierung (d. h. die Anzahl der Rezeptoren) reichte bei den koffeinbehandelten Probanden nicht aus, um eine Verschiebung der ADP-induzierten Aggregationskonzentrations-Wirkungskurve zu bewirken. Wenn jedoch die Menge an endogenem Adenosin ansteigt, wie z. B. während einer Myokardischämie, steigt die extrazelluläre Adenosinkonzentration schnell auf ein Niveau an, das ausreicht, um auf die hochregulierten Rezeptoren zu wirken, und kann größere plättchenhemmende Wirkungen als die Kontrolle haben. Daher ist es möglich, dass chronischer Koffeinkonsum in Dosen, die nicht weit von der durchschnittlichen Nahrungsaufnahme entfernt sind, zu einer paradoxen Verringerung der Thrombozytenaggregierbarkeit während der Ischämie führen kann.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass alle Daten zusammen einen weiteren Beweis dafür liefern, dass die chronische Einnahme von Koffein die Reaktion der Thrombozyten auf die Wirkung von Adenosin verändert. Die wichtigste Erkenntnis der vorliegenden Studie ist, dass die Auswirkungen des chronischen Koffeinkonsums auf die Thrombozytenfunktionen sowohl von der Dosis als auch von der Dauer der Behandlung abhängen und einer Verringerung der Thrombozytenaggregierbarkeit aufgrund einer Hochregulierung der Adenosin-A2A-Rezeptoren zugrunde liegen.