RuBisCO

RuBisCO er et af mange enzymer i Calvin-cyklusen. Når Rubisco letter angrebet af CO2 på C2-kulstoffet i RuBP og den efterfølgende bindingsspaltning mellem C3- og C2-kulstoffet, dannes der 2 molekyler glycerat-3-fosfat. Omdannelsen omfatter disse trin: enolisering, carboxylering, hydrering, C-C-bindingsspaltning og protonering.

SubstraterRediger

Substrater for RuBisCO er ribulose-1,5-bisphosphat og kuldioxid (forskelligt fra den “aktiverende” kuldioxid). RuBisCO katalyserer også en reaktion af ribulose-1,5-bisfosfat og molekylær ilt (O
2) i stedet for kuldioxid (CO
2). skelnen mellem substraterne CO2 og O2 tilskrives de forskellige interaktioner af substratets quadrupolmomenter og en høj elektrostatisk feltgradient. Denne gradient etableres af dimerformen af den minimalt aktive RuBisCO, som med sine to komponenter giver en kombination af modsat ladede domæner, der er nødvendige for enzymets interaktion med O2 og CO
2. Disse betingelser er med til at forklare den lave omsætningshastighed, der er fundet i RuBisCO: For at øge styrken af det elektriske felt, der er nødvendigt for tilstrækkelig interaktion med substraternes quadrupolmomenter, skal enzymets C- og N-terminale segmenter lukkes af, hvilket gør det muligt at isolere det aktive sted fra opløsningsmidlet og sænke den dielektriske konstant. Denne isolation har en betydelig entropisk omkostning og resulterer i den dårlige omsætningshastighed.

Binding RuBPEdit

Carbamylering af ε-aminogruppen af Lys201 stabiliseres af koordination med Mg2+. Denne reaktion involverer binding af carboxylat-terminalerne af Asp203 og Glu204 til Mg2+-ionen. Substratet RuBP binder Mg2+ og fortrænger to af de tre aquoligander.

EnoliseringRediger

Enolisering af RuBP er omdannelsen af keto tautomeren af RuBP til en enediol(ate). Enolisering indledes ved deprotonering ved C3. Enzymbasen i dette trin er blevet diskuteret, men de steriske begrænsninger, der er observeret i krystalstrukturer, har gjort Lys201 til den mest sandsynlige kandidat. Specifikt deprotonerer carbamat-syren på Lys201, som ikke er koordineret med Mg-ionen, C3-kulstoffet i RuBP for at danne et 2,3-enediolat.

CarboxyleringRediger

Carboxylering af 2,3-enediolat resulterer i det mellemliggende 3-keto-2′-carboxyarabinitol-1,5-bisphosphat, og Lys334 er placeret til at lette tilsætningen af CO2-substratet, da det erstatter det tredje Mg2+-koordinerede vandmolekyle og føjer sig direkte til enediolet. Der dannes ikke noget Michaelis-kompleks i denne proces. Hydrering af denne keton resulterer i en yderligere hydroxygruppe på C3, hvilket danner et gem-diolintermediat. Carboxylering og hydrering er blevet foreslået som enten et enkelt samordnet trin eller som to på hinanden følgende trin. Den samordnede mekanisme understøttes af vandmolekylets nærhed til C3 i RuBP i flere krystalstrukturer. I spinatstrukturen er andre rester velplaceret til at hjælpe med hydreringstrinnet, da de er inden for hydrogenbindingsafstand fra vandmolekylet.

C-C-bindingsspaltningRediger

Gem-diolintermediæret spaltes ved C2-C3-bindingen for at danne et molekyle glycerat-3-fosfat og et negativt ladet carboxylat. Stereospecifik protonering af C2 af dette carbanion resulterer i endnu et molekyle glycerat-3-fosfat. Dette trin menes at blive lettet af Lys175 eller potentielt det carbamylerede Lys201.

ProdukterRediger

Når kuldioxid er substratet, er produktet af carboxylasereaktionen et ustabilt fosforyleret mellemprodukt med seks kulstof, kendt som 3-keto-2-carboxyarabinitol-1,5-bisphosphat, som hurtigt henfalder til to molekyler glycerat-3-fosfat. 3-fosfoglyceratet kan bruges til at producere større molekyler som f.eks. glukose.

Rubiscos sideaktiviteter kan føre til ubrugelige eller hæmmende biprodukter; et sådant produkt er xylulose-1,5-bisfosfat, som hæmmer Rubisco-aktiviteten.

Når molekylær oxygen er substratet, er produkterne af oxygenasereaktionen fosfoglycolat og 3-fosfoglycerat. Phosphoglycolat genanvendes gennem en sekvens af reaktioner kaldet fotorespiration, som involverer enzymer og cytokromer placeret i mitokondrier og peroxisomer (dette er et tilfælde af metabolitreparation). I denne proces omdannes to molekyler fosfoglycolat til et molekyle kuldioxid og et molekyle 3-fosfoglycerat, som igen kan indgå i Calvin-cyklusen. Noget af det fosfoglycolat, der kommer ind i denne vej, kan beholdes af planterne til produktion af andre molekyler, f.eks. glycin. Ved det omgivende niveau af kuldioxid og ilt er forholdet mellem reaktionerne ca. 4 til 1, hvilket resulterer i en nettokuldioxidbinding på kun 3,5. Enzymets manglende evne til at forhindre reaktionen med ilt reducerer således i høj grad den fotosyntetiske kapacitet hos mange planter. Nogle planter, mange alger og fotosyntetiske bakterier har overvundet denne begrænsning ved at udtænke metoder til at øge koncentrationen af kuldioxid omkring enzymet, herunder C4-kulstoffiksering, crassulacesyremetabolisme og brug af pyrenoid.

Hastighed af enzymatisk aktivitetRediger

Nogle enzymer kan udføre tusindvis af kemiske reaktioner hvert sekund. RuBisCO er imidlertid langsom og fikserer kun 3-10 kuldioxidmolekyler hvert sekund pr. enzymmolekyle. Den reaktion, der katalyseres af RuBisCO, er således den primære hastighedsbegrænsende faktor i Calvin-cyklusen i løbet af dagen. Ikke desto mindre reagerer RuBisCO’s hastighed under de fleste forhold, og når lyset ikke på anden måde begrænser fotosyntesen, positivt på stigende kuldioxidkoncentration.

RuBisCO er normalt kun aktiv om dagen, da ribulose 1,5-bisphosphat ikke regenereres i mørke. Dette skyldes reguleringen af flere andre enzymer i Calvin-cyklusen. Desuden koordineres aktiviteten af RuBisCO med aktiviteten af de andre enzymer i Calvin-cyklusen på flere andre måder:

Ved ionerRediger

Ved belysning af kloroplasterne stiger pH-værdien i stromaet fra 7,0 til 8,0 på grund af den proton (hydrogenion, H+
) gradient, der skabes på tværs af thylakoidmembranen. Bevægelsen af protoner ind i thylakoiderne er drevet af lys og er grundlæggende for ATP-syntesen i kloroplaster (Yderligere læsning: Fotosyntetisk reaktionscenter; Lysafhængige reaktioner). For at afbalancere ionpotentialet på tværs af membranen bevæger magnesiumioner (Mg2+
) sig som reaktion ud af thylakoiderne, hvilket øger koncentrationen af magnesium i stromaet i kloroplasterne. RuBisCO har en høj optimal pH-værdi (kan være >9,0, afhængigt af magnesiumionkoncentrationen) og bliver således “aktiveret” ved at indføre kuldioxid og magnesium til de aktive steder som beskrevet ovenfor.

Ved RuBisCO-aktivaseRediger

I planter og nogle alger er et andet enzym, RuBisCO-aktivase (Rca, GO:0046863, P10896), nødvendigt for at muliggøre den hurtige dannelse af den kritiske carbamat i RuBisCO’s aktive site. Dette er nødvendigt, fordi ribulose 1,5-bisfosfat (RuBP) binder sig stærkere til RuBisCO’s aktive steder, når der er overskydende carbamat til stede, hvilket forhindrer processerne i at bevæge sig fremad. I lyset fremmer RuBisCO-aktivase frigørelsen af det hæmmende (eller – i nogle opfattelser – lagrende) RuBP fra RuBisCO’s katalytiske steder. Aktivase er også påkrævet i nogle planter (f.eks. tobak og mange bønner), fordi RuBisCO i mørke hæmmes (eller beskyttes mod hydrolyse) af en kompetitiv inhibitor, der syntetiseres af disse planter, en substratanalog 2-Carboxy-D-arabitinol 1-phosphat (CA1P), som er en substratanalog. CA1P binder sig tæt til det aktive sted for carbamyleret RuBisCO og hæmmer den katalytiske aktivitet i endnu højere grad. CA1P har også vist sig at holde RuBisCO i en konformation, der er beskyttet mod proteolyse. I lyset fremmer RuBisCO-aktivase også frigørelsen af CA1P fra de katalytiske steder. Når CA1P er frigjort fra RuBisCO, omdannes det hurtigt til en ikke-inhiberende form af en lysaktiveret CA1P-fosfatase. Selv uden disse stærke inhibitorer bliver de normale reaktioner med kuldioxid eller ilt ikke afsluttet en gang for hver flere hundrede reaktioner; der dannes stadig andre inhiberende substratanaloger i det aktive sted. Endnu en gang kan RuBisCO-aktivase fremme frigivelsen af disse analoger fra de katalytiske steder og opretholde enzymet i en katalytisk aktiv form. Ved høje temperaturer aggregerer RuBisCO-aktivase imidlertid og kan ikke længere aktivere RuBisCO. Dette bidrager til den nedsatte carboxyleringskapacitet, der er observeret under varmestress.

Ved ATP/ADP og stromal reduktions-/oxidationstilstand gennem aktivasenRediger

Afskaffelse af de hæmmende RuBP, CA1P og de andre hæmmende substratanaloger ved aktivase kræver forbrug af ATP. Denne reaktion hæmmes af tilstedeværelsen af ADP, og aktivaseaktiviteten afhænger således af forholdet mellem disse forbindelser i chloroplaststromaet. I de fleste planter ændres aktivasens følsomhed over for forholdet mellem ATP/ADP desuden af stromaets reduktions/oxidationstilstand (redox) gennem et andet lille regulerende protein, thioredoxin. På denne måde kan aktivaseaktiviteten og aktiveringstilstanden af RuBisCO moduleres som reaktion på lysintensiteten og dermed dannelseshastigheden af ribulose 1,5-bisfosfat-substratet.

Ved fosfatRediger

I cyanobakterier deltager uorganisk fosfat (Pi) også i den koordinerede regulering af fotosyntesen: Pi binder sig til RuBisCO’s aktive sted og til et andet sted på den store kæde, hvor det kan påvirke overgangene mellem aktiverede og mindre aktive konformationer af enzymet. På denne måde kan aktivering af bakteriel RuBisCO være særlig følsom over for Pi-niveauet, hvilket kan få den til at virke på samme måde som RuBisCO-aktivasen fungerer i højere planter.

Ved hjælp af kuldioxidRediger

Da kuldioxid og ilt konkurrerer ved RuBisCO’s aktive sted, kan kulstoffiksering ved hjælp af RuBisCO forbedres ved at øge kuldioxidniveauet i det rum, der indeholder RuBisCO (chloroplaststroma). Flere gange i løbet af planternes udvikling har der udviklet sig mekanismer til at øge kuldioxidniveauet i stromaet (se C4-kulstoffiksering). Brugen af ilt som substrat synes at være en gådefuld proces, da den synes at kaste opfanget energi væk. Det kan imidlertid være en mekanisme til at forhindre kulhydratoverbelastning i perioder med høj lysstrøm. Denne svaghed i enzymet er årsagen til fotorespiration, således at sunde blade i stærkt lys kan have nul nettokulstoffiksering, når forholdet mellem O
2 og CO
2, der er tilgængeligt for RuBisCO, skifter for meget i retning af ilt. Dette fænomen er primært temperaturafhængigt: Høje temperaturer kan reducere koncentrationen af CO
2 opløst i fugten i bladvæv. Dette fænomen er også relateret til vandstress: Da planteblade afkøles ved fordampning, forårsager begrænset vand høje blattemperaturer. C4-planter anvender i første omgang enzymet PEP-carboxylase, som har en højere affinitet for CO
2. Processen skaber først et 4-kulstofmellemprodukt, som transporteres til et sted i C3-fotosyntesen og derefter decarboxyleres, hvorved der frigives CO
2, hvilket øger koncentrationen af CO
2, deraf navnet C4-planter.

Crassulacesyremetabolisme (CAM) planter holder deres spalteåbninger lukket om dagen, hvilket sparer vand, men forhindrer de lysuafhængige reaktioner (alias Calvin-cyklusen) i at finde sted, da disse reaktioner kræver, at CO
2 passerer ved gasudveksling gennem disse åbninger. Fordampning gennem oversiden af et blad forhindres af et lag voks.