Resultater og diskussion
VARV Genome Stability and Phylogenetic Analysis.
Den tilgængelige genomsekvens fra en samling af VARV-isolater med en bred geografisk fordeling (Fig. 1) blev brugt til den evolutionære undersøgelse af VARV (4). VARV, der tilhører slægten Orthopoxvirus, indeholder et enkelt lineært dobbeltstrenget DNA-genom på 186 kb, der koder for de fleste enzymer til dets formering (5). De undersøgte VARV-isolater udviste en lav mutationsrate, fordi epidemiologisk forbundne isolater viste få eller ingen sekvensændringer i prøver med op til et års mellemrum mellem indsamlingstidspunkterne. Denne lave mutationsrate kan tydeligt ses i vores genetisk identiske prøver fra Bangladesh, der blev indsamlet mellem 1974 og 1975. Disse prøver repræsenterer helt sikkert lange komplekse transmissionskæder fra et af de tættest befolkede områder i verden, men de har identiske eller næsten identiske nukleotidsekvenser. Den beslægtede Orthopoxvirus monkeypox-virus viser ligeledes enkelte eller ingen nukleotidændringer blandt isolater fra tre forskellige værter i et nyligt udbrud i USA (6). Inden for og på tværs af arter af ortopoxvirus har genomerne nukleotididentiteter på >99,6 % blandt VARV-isolater og 98 % blandt VARV og beslægtede taxa såsom taterapoxvirus (TATV) (4) (Vestafrika) og camelpoxvirus (CMLV) (7) (Centralasien) (tabel 1), de to arter med den største sekvenslighed med VARV (4). Den store størrelse og den langsomme nukleotid-substitutionshastighed gør det muligt for VARV-genomisk DNA at bevare fylogenetisk informative mutationer, samtidig med at forekomsten af homoplastiske mutationer (dvs. færre omvendinger af karaktertilstande) mindskes. Diversiteten af 47 nyligt sekventerede VARV-genomer var i vid udstrækning forbundet med isolaternes geografiske oprindelse (ref. 4 og denne undersøgelse), og mutationer havde minimal sammenhæng med tidsmæssig variation på tværs af isolater. Disse observationer viser, at der ikke var tale om en enkelt pandemisk stamme ( SI-tekst , note 1), men snarere at de genetiske klader i disse analyser er repræsentative for gamle og måske gamle lokalt endemiske stammer.
Hypoteser om VARV’s oprindelse. Begivenhed 0, Den store lighed mellem VARV og CMLV- og TATV-genomsekvenser tyder på, at TATV og CMLV deler en nyere fælles forfader med VARV end andre kendte ortopoxvirusarter. Begivenhed 1, hypotese A: En forfader-VARV er blevet opdelt i to primære klader (P-I og P-II) og har udviklet sig uafhængigt af hinanden i den gamle og den nye verden ved at følge sine menneskelige værter. Begivenhed 1, hypotese B: Divergens af P-I/P-II i Afrika. Begivenhed 2, hypoteser A og B: Den lange enkeltgren og den efterfølgende udstråling af P-I tyder på, at P-I’s forfædres VARV sandsynligvis stammer fra Nordøstasien, og at P-I’s kopper endemer begyndte at sprede sig til Østasien, Mellemøsten og Indien, efterhånden som de lokale populationer blev tilstrækkeligt store. Begivenhed 2a, diversificering og migration af P-I i hele Asien. Begivenhed 2b, vestlig udforskning bragte VARV major til Sydafrika fra det indiske subkontinent, som derefter spredte sig nordpå til Centralafrika og Afrikas Horn (Somali-halvøen). Begivenhed 3 og 4, hypotese A: diversificering af P-II i den nye verden efterfulgt af genindførelse af den i Afrika; hypotese B: Hypotese B: Diversificeringen af P-II i Afrika efterfulgt af en senere introduktion af en subklasse i den Nye Verden.
Hvis P-I-strålingen repræsenterer kopperens endemiske historie i den gamle verden, forklarer det den historiske gåde med hensyn til fraværet af en beskrivelse af kopper i litteraturen fra de gamle græske og romerske civilisationer (1). Det er sandsynligt, at koppeepidemierne i denne region opstod på et senere tidspunkt end dem i det gamle Kina og Indien. Den af Thukydides beskrevne “Athenepidemi” i 430 f.Kr., som engang blev anset for at være kopper (3), ville modsige denne teori, men det er for nylig blevet fastslået, at det var tyfus (25). Under Ramses V’s regeringstid var Egypten i borgerkrig og blev angrebet af fjender fra nord (3); hvis Ramses V’s pustuløse udbrud var fra kopper, kunne det repræsentere et koppeudbrud fra importerede tilfælde på grund af krig snarere end en regional endemisk sygdom. Denne hypotese understøttes af det faktum, at kun tre mumier i den periode havde lignende læsioner (2).
Diversificering af alastrim minor.
De koppehistorie/VARV-topologibaserede analyser viser, at divergensen af alastrim minor og vestafrikansk variola begyndte for mindst 800 år siden (Tabel 2 og SI Tabel 4), hvilket går forud for den tidligere hypotese om, at denne divergens falder sammen med slavehandelens begyndelse. I henhold til den mere gamle oprindelseshypotese kan denne divergens være opstået efter en artsdannelse i enten den Nye Verden (baseret på kalibreringen fra de tidligste historiske optegnelser om kopper; Fig. 3 A) eller Vestafrika (baseret på kalibreringen fra de sydafrikanske historiske optegnelser om kopper; Fig. 3 B). Disse scenarier tyder på, at der fandtes uidentificerede variola minor/alastrim-isolater i enten Afrika eller den Nye Verden meget tidligere end opdagelsen af alastrim minor (P-II); dette taxon har således en længere historie, end der er blevet beskrevet.
Og selv om den veldokumenterede import af VARV major til Amerika havde en ødelæggende effekt på mange af de indfødte befolkninger (2), kan de registrerede registreringer af hurtig spredning af sygdommen med stor dødelighed til dels tilskrives den kombinerede effekt af den høje befolkningstæthed, mangel på grundlæggende pleje af ofrene og potentielle co-infektioner med andre sygdomme fra den gamle verden (26, 27). Historisk set er der kun få optegnelser om kopper i Vestafrika, og Henige (28) hævdede, at det første VARV store koppeudbrud i den nye verden ikke stammede fra Vestafrika, hvilket ville modbevise hypotesen om en tidlig koppehistorie i Vestafrika. Det er muligt, at alastrim efter en gammel introduktion udviklede sig uafhængigt i isolerede regioner inden for det store geografiske område i den Nye Verden. Faktisk viste Phelans undersøgelse, at de indfødte befolkninger i Ecuadors højland ikke faldt under det første spanske styre (som tilskrives at have indført VARV major til den nye verden) (29), hvilket tyder på, at disse befolkninger kunne have været mere modstandsdygtige over for kopper, måske ved tidligere kontakt med alastrim. I Trinidad blev det dokumenteret, at et mildt koppeudbrud i 1902 stammede fra denne region (30). Hvis denne diversificering fandt sted i den Nye Verden, ville den primære isoleringsbegivenhed sandsynligvis være opstået som følge af flytning af en forfaderlig VARV med tidlige mennesker til denne region (Fig. 4A). Fraværet af SNP-signaturer, der tyder på blanding mellem P-I og P-II (SI Fig. 6 og 7), de konsekvente og signifikant forskellige kliniske egenskaber ved alastrim fra traditionel VARV major af P-I (31), kunne forklares ved en sådan betydelig geografisk adskillelse.
Hvis opsplitningen af P-I/P-II fandt sted inden for den gamle verden, stammer P-II sandsynligvis fra Vestafrika. De to P-II-subklader ville derefter have divergeret ≈800-1.100 YBP (Tabel 2 og SI Tabel 4) på det afrikanske kontinent. Den geografiske fordeling af disse begivenheder er vanskelig at bestemme på grund af mangel på skriftlig historie i disse regioner. Tilstedeværelsen og diversificeringen af andre nært beslægtede ortopoxvirusser som f.eks. abepox og TATV kunne imidlertid understøtte en afrikansk oprindelse for forfædres VARV’er. Hvis isolationen og diversifikationen af P-II fandt sted i Afrika, så er der, baseret på vores fylogeni, en ubeskrevet afrikansk repræsentant fra P-II-subklassen, som blev indført i den Nye Verden måske flere hundrede år efter diversifikationsbegivenheden, muligvis i forbindelse med slavehandelen mellem lande i den gamle og den nye verden (Fig. 3 B).
En utilstrækkelig forståelse af disse kulturers historie og de relativt mildere kliniske symptomer (i forhold til variola major) bidrager til fraværet af en mere omfattende historisk registrering af koppesygdom(e) i enten den Nye Verden eller Afrika syd for Sahara. Den historiske befolkningstæthed i begge disse regioner var lavere end i de regioner, hvor variola major er endemisk. I tilfælde af mildere sygdom ville enkeltpersoner have været mere mobile, når de var smittefarlige, og ville have haft et større antal kontakter og dermed have videreført spredningen af sygdommen. Til støtte for denne hypotese kan det nævnes, at de milde koppeudbrud i Somalia varede i lange perioder blandt små nomadebander og viste et betydeligt anderledes transmissionsmønster sammenlignet med det af VARV major (2). Selv om det er ukendt, om de oprindelige folk i Afrika eller Amerika anvendte variolation/impulering, ville VARV’s lange levetid i rekonvalescerende skurv (op til et årti) (32-34) give endnu en mekanisme for gentagen introduktion af en koppestamme i et geografisk samfund enten ved utilsigtet kontakt med skurvmaterialer eller direkte gennem variolationspraksis.
Origin af VARV.
Mulige ledetråde vedrørende tilpasningen af VARV til mennesker kan findes i det tætte forhold mellem VARV og TATV/CMLV (4). TATV er forbundet med en landlevende gnaver, der er hjemmehørende i Vestafrika (35). Vores koalescensanalyser viser, at divergensen mellem VARV og TATV fandt sted fra 16.000 YBP (Tabel 2 og SI Datasæt 4, baseret på de koppehistoriske optegnelser fra Sydafrika) til 68.000 YBP (Tabel 2 og SI Datasæt 3, baseret på den tidligst registrerede koppehistorie i Østasien). Som de beslægtede zoonotiske ortopoxvirusser med gnaverreservoirer (6, 36, 37) kan VARV således have udviklet sig fra et enzootisk patogen hos afrikanske gnavere og efterfølgende spredt sig ud af Afrika.
De genomiske sekvenser af VARV-isolater, der er udvalgt til denne undersøgelse, blev taget fra World Health Organization Collaborating Center repository, og selv om de udviser et lavt niveau af sekvensdivergens, er de repræsentative for den største geografiske og tidsmæssige diversitet inden for samlingen. Den cSNP-afledte fylogeni af disse isolater giver en topologi, der stemmer overens med historiske menneskelige migrationsmønstre, befolkningsekspansion og dokumenterede koppeepidemier. Den afbildede topologi støtter en hypotese (Fig. 3) om, at to klader af variola er divergeret fra en forfadervirus og efterfølgende har udviklet sig i geografisk adskilte menneskelige populationer. Selv om årsagen til den forskellige patogenese hos mennesker af alastrim og VARV major er uklar, tilføjer den genetiske struktur af alastrim minor og dens topologi sammen med de andre VARV-isolater vigtige brikker til det evolutionære puslespil om kopper. Denne foreslåede fylogeni af VARV forlænger den evolutionære tid for kopper i forhold til tidligere teorier.