Højtydende væskekromatografi (HPLC) er en form for kolonnekromatografi, hvor en prøveblanding eller analysand i et opløsningsmiddel (kendt som den mobile fase) pumpes under højt tryk gennem en kolonne med kromatografisk pakkemateriale (stationær fase). Prøven transporteres af en bevægelig bæregasstrøm af helium eller nitrogen. HPLC har evnen til at adskille og identificere forbindelser, der er til stede i enhver prøve, som kan opløses i en væske, i sporkoncentrationer så lave som dele pr. trillion. På grund af denne alsidighed anvendes HPLC i en lang række industrielle og videnskabelige anvendelser, f.eks. inden for farmaceutiske, miljømæssige, retsmedicinske og kemiske områder.
Provens retentionstid vil variere afhængigt af interaktionen mellem den stationære fase, de molekyler, der analyseres, og det eller de anvendte opløsningsmidler. Når prøven passerer gennem kolonnen, interagerer den mellem de to faser med forskellig hastighed, primært på grund af forskellige polariteter i analysanderne. Analyter, der har mindst interaktion med den stationære fase eller mest interaktion med den mobile fase, vil forlade kolonnen hurtigere.
Instrumentering:
De vigtigste komponenter i et HPLC-system omfatter opløsningsmiddelreservoiret eller flere reservoirer, en højtrykspumpe, en kolonne, et injektorsystem og detektoren.
Detektionsgrænse |
Gasanbefaling |
Regulatoranbefaling |
| Spurgegas | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 serie |
Reservoiret indeholder opløsningsmidlet, som kaldes den mobile fase, fordi det bevæger sig. Der er normalt mindst to reservoirer i et system, som hver rummer op til 1000 cc opløsningsmiddel, og som normalt er udstyret med en gasdiffusor, hvorigennem helium kan bobles. Der anvendes en pumpe til at generere en bestemt strøm af den mobile fase. Selv om det stadig er muligt at injicere prøverne manuelt, er de fleste HPLC’er nu fuldt automatiserede og styres af en computer. Injektoren eller den automatiske prøveudtager indfører opløsningsmidlet i en fasestrøm, der fører prøven ind i højtrykskolonnen (op til 400 bar), som indeholder det specifikke pakkemateriale, der er nødvendigt for at opnå separation. Pakningsmaterialet betegnes som den stationære fase, fordi det holdes på plads af kolonnens hardware.
Der er behov for en detektor for at kunne se de separerede forbindelsesbånd, når de elueres fra højtrykskolonnen. Oplysningerne sendes fra detektoren til en computer, som genererer kromatogrammet. Den mobile fase forlader detektoren og sendes enten til et affald eller opsamles efter ønske.
Heliumsparging er en effektiv metode til afgasning af den mobile fase for at undgå ustabile grundlinjer forårsaget af opløst luft. Kvælstof anvendes som forstøvergas i en ELSD-detektor (Evaporative Light Scattering Detector), hvor opløsningsmidlet fordampes fra prøven og efterlader en tåge, der måles.
Højtydende væskekromatografi – andre HPLC-typer
Ultra højtydende væskekromatografi (uHPLC):
Hvor standard-HPLC typisk anvender kolonnepartikler med størrelser fra 3 til 5 µm og tryk på omkring 400 bar, anvender uHPLC specielt konstruerede kolonner med partikler på ned til 1,7 µm ved tryk på over 1000 bar. Den største fordel ved en uHPLC er hastigheden. Disse systemer er hurtigere og mere følsomme og er afhængige af mindre mængder organiske opløsningsmidler end standard-HPLC, hvilket giver mulighed for at køre flere prøver på kortere tid. Hvis systemerne køres ved typiske tryk på mere end 800 bar, ældes eller nedbrydes kolonnerne imidlertid hurtigere. Der er ved at blive udviklet nyere teknologi til uHPLC-enheder til brug af søjlepartikler med en størrelse på 1 µm og trykpotentialer på op til 6 800 bar.
uHPLC er også kendt som UPLCTM, som er et varemærke tilhørende Waters Corporation.
Flash protein liquid chromatography (FPLC):
FPLC er et system, der ligner højtydende væskekromatografi, og som anvendes til at adskille eller rense proteiner og andre biomolekyler fra komplekse blandinger. Den væsentligste forskel mellem FPLC og HPLC er standardarbejdstrykket. FPLC-kolonner kan kun anvendes op til et maksimalt tryk på 3-5 MPa. Hvis trykket i HPLC’en kan begrænses, kan næsten alle FPLC-søjler også anvendes i et HPLC-system.