Dosis- og tidseffekter af koffeinindtag på humane blodplade-Adenosin A2A-receptorer

Koffein, der findes i forskellige kilder som kaffe, te, chokolade og coladrikke, er det mest udbredte aktive stof i verden. Det gennemsnitlige koffeinforbrug hos voksne mennesker varierer mellem forskellige kulturer og nationer fra 80 til 400 mg pr. person pr. dag.1 Koffein fremkalder en række forskellige farmakologiske reaktioner, herunder øget årvågenhed, nedsat psykomotorisk reaktionstid og øget søvnlatens og opvågningstid, og kan også påvirke den intellektuelle præstation.2 Desuden forårsager koffein afslapning af glatte muskler, øger sekretionen af mavesyre og frigivelsen af katekolaminer og øger den metaboliske aktivitet.3

Den præcise mekanisme(r), der ligger til grund for virkningerne af koffein, er stadig dårligt defineret. Selv om inhibering af fosfodiesteraser kan bidrage til koffeinets virkninger,4 er der stadig flere beviser for, at de fleste farmakologiske virkninger af denne xanthin skyldes antagonisme af adenosinreceptorer, der betegnes som A1-, A2A-, A2B- og A3-subtyper.5 Koffein virker mest potent på A2A-receptorer, tæt efterfulgt af A1-receptorer, derefter A2B-receptorer,6 og som en svag antagonist på menneskelige A3-receptorer. Blokering med koffein af adenosinreceptorer, nemlig A1- og A2A-receptortyperne, hæmmer virkningen af endogent adenosin på en række fysiologiske processer.7 Under normale forhold synes blodets adenosinniveauer at være tilstrækkelige til tonisk at aktivere A2A-receptorer i blodpladerne. For nylig blev det rapporteret, at der hos A2A-receptor-knockout-mus var øget blodpladeaggregation, hvilket indikerer betydningen af denne receptorsubtype for blodpladernes funktion8 . Det er derfor tænkeligt, at koffein kan blokere disse tonisk aktiverede A2A-receptorer i blodpladerne og ændre deres funktioner, der moduleres af adenosin.

I mange år har der været mistanke om en sammenhæng mellem kaffedrikning og hjerte-kar-sygdomme, især koronar hjertesygdom9 , men for nylig er det blevet påvist, at kaffe- eller koffeinforbrug ikke øger risikoen for koronar hjertesygdom eller slagtilfælde.1011 Talrige epidemiologiske undersøgelser med hensyn til myokardieinfarkt har ikke fundet nogen skadelig virkning af <5 kopper kaffe om dagen, mens resultaterne er kontroversielle ved højere indtagelsesniveauer.12 Hos patienter med forhøjet blodtryk blev der ikke observeret nogen risiko for et negativt resultat uanset koffeinindtag13 .

En undersøgelse af Biaggioni et al.14 fandt, at en gentagen doseringsregime af koffein fører til betydelige ændringer i humane blodplader i de funktionelle reaktioner på adenosinreceptoragonisten 5′-N-ethylcarboxamidoadenosin (NECA). Koffeinudtagning medførte en betydelig forskydning mod venstre af den NECA-inducerede hæmning af aggregering.14 I overensstemmelse hermed påviste vi for nylig15 hos forsøgspersoner, der blev behandlet med 750 mg/d i 1 uge, at kronisk indtagelse af koffein ændrer trombocytaggregabiliteten som følge af opregulering af A2A-receptorerne på trombocytoverfladen.

I denne artikel giver vi yderligere bevis for, at der findes et lignende respons hos forsøgspersoner, der behandles med koffein i forskellige doser, f.eks. 600 mg/d i 1 uge eller 400 mg/d, der indgives i en længere periode, f.eks. i 2 uger. I den foreliggende undersøgelse blev dette gjort ved direkte at måle ændringer i adenosin A2A-receptorerne (tæthed og affinitet) og deres funktion ved at bestemme effekten af den A2A-selektive agonist 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) for at (1) øge cAMP-akkumulationen, (2) hæmme trombocytaggregation og (3) sænke de intracellulære calciumniveauer. Efter kronisk indtagelse (600 mg/d i 1 uge eller 400 mg/d i 2 uger) blev der fundet en opregulering af trombocytadenosin A2A-receptorer, som var stærkt korreleret med antiaggregatoriske virkninger, en stigning i cAMP-akkumulering og et fald i de intracellulære calciumniveauer. Der blev ikke afsløret nogen forskelle på bindings- og funktionelle parametre fra forsøgspersoner behandlet med 400 mg/d i 1 uge.

Metoder

Forty-five raske, ikke-rygende forsøgspersoner, 25 til 45 år, af begge køn, blev undersøgt. Efter at have givet skriftligt informeret samtykke blev emnerne bedt om at afholde sig fra methylxanthiner i kosten i ≥2 uger. De blev inddelt i 3 grupper (15 forsøgspersoner hver) i henhold til koffeinadministrationsregime (dvs. dosis og varighed af administrationen): 200 mg oralt 2 gange om dagen i en periode på 7 dage (gruppe 1); 200 mg oralt 2 gange om dagen i en periode på 14 dage (gruppe 2); og 200 mg oralt 3 gange om dagen i en periode på 7 dage (gruppe 3). Trombocytter fra disse forsøgspersoner blev undersøgt, før de begyndte at tage koffein (dag 0) og 1, 12, 60 og 108 timer efter den sidste dosis koffein. Især blev 1-timerstidspunktet kun undersøgt i den gruppe, der fik den maksimale dosis koffein (600 mg/d). EC50 og IC50 i funktionelle assays kunne ikke opnås ved 1 time på grund af de praktiske problemer i forbindelse med overdreven blodprøvetagning i et snævert tidsrum (1 til 12 timer)

SCH 58261-bindingsassay i humane trombocytmembraner

Membraner fra humane trombocytter blev fremstillet som tidligere beskrevet16 og anvendt til radioligandbindingsassays med SCH 58261 i henhold til Varani et al.17 I mætningsundersøgelser blev humane trombocytmembraner inkuberet med 8 til 10 forskellige koncentrationer af SCH 58261, der varierede fra 0,01 til 10 nmol/L. Ikke-specifik binding blev bestemt i tilstedeværelse af NECA 10 μmol/L. Efter 60 minutters inkubation ved 4 °C blev prøverne filtreret gennem Whatman GF/B-filtre med en Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co.). Et vægtet ikke-lineært mindst kvadratisk kurvetilpasningsprogram, LIGAND,18 blev anvendt til computeranalyse af dataene fra mætningseksperimenterne.

Måling af cAMP-niveauer i humane trombocytter

Vaskede humane trombocytter fremstillet fra det perifere blod fra raske frivillige blev fremstillet som tidligere beskrevet.16 Trombocytter (6×104 til 8×104 celler) blev inkuberet med 1,0 U adenosindeaminase/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidazolidinon (Ro 20-1724) som fosfodiesteraseinhibitor og 6 til 8 forskellige koncentrationer af HE-NECA. EC50-værdier blev opnået fra koncentrations-respons kurver efter log-logit transformation af afhængige variabler ved en vægtet mindste kvadraters metode.19 Den endelige vandige opløsning blev testet for cAMP-niveauer ved et konkurrenceproteinbindingsassay.15

Platelet Aggregation Assay

Citreret menneskeblod blev centrifugeret ved 200g i 10 minutter for at opnå trombocyt-rigt plasma og ved 2500g i 20 minutter for at opnå trombocytfattigt plasma. Der blev foretaget tælling af menneskelige trombocytter i en Coulter Counter model S8/80 (Coulter Electronics Inc.) og justeret til 2,5 × 108/mL til 3,5 × 108/mL med autologt trombocytfattigt plasma. Trombocytaggregation blev udført i overensstemmelse med den turbidimetriske Born-teknik20 med en DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Efter inkubation i 3 minutter med 6 til 8 forskellige koncentrationer af HE-NECA blev trombocytterigt plasma aggregeret ved 37 °C under kontinuerlig omrøring med ADP. Lignende eksperimenter blev udført med ADP i forskellige koncentrationer (100 nmol/L til 100 μmol/L). Den maksimale aggregering, der blev registreret 5 minutter efter tilsætning af ADP, blev anvendt til den kvantitative analyse, og procentdelen af hæmning blev beregnet i forhold til kontrolværdierne.21

Målinger af den frie Ca2+-koncentration i cytoplasmaet

Den frie calciumkoncentration i cytosol blev målt ved hjælp af fura 2-teknikken i henhold til Paul et al.22 Kort fortalt blev blodpladerne inkuberet i totalt mørke i 30 minutter ved 37 °C med 1 μmol/L fura 2-AM og magnetisk omrørt i fluorimeterkuvetter (LS50, Perkin Elmer, Ltd) ved en koncentration på 108/mL i nærværelse af 250 μmol/L sulfinpyrazon. Intracellulær Ca2+-koncentration (i) blev bestemt ved et excitationsforhold på 340/380 og en emissionsbølgelængde på 505 nm.

Statistisk analyse

Analyse af data blev udført ved 1-vejs ANOVA. Analyse af forskellen mellem koffeinbehandlede grupper (12, 60 og 108 timer) og kontrolpersoner blev foretaget med Student’s t-test (uparret analyse). Forskelle blev betragtet som signifikante ved en værdi på P<0,01. Alle data er rapporteret som gennemsnit±SEM.

Resultater

Plader fra de 3 grupper af forsøgspersoner blev høstet, før administrationen af koffein blev påbegyndt (dag 0, kontrol) og 1, 12, 60 og 108 timer efter den sidste dosis (koffeinudtagning). Tabellen opsummerer resultaterne af bindings- og funktionelle eksperimenter fra de 3 grupper af forsøgspersoner.

Gruppe 1 (400 mg/d i 1 uge)

Bindingsparametre afslørede en kontrol Bmax-værdi på 105±6 fmol/mg protein og en KD-værdi på 1,28±0,08 nmol/L. I kontroltrombocytter øgede HE-NECA cAMP-niveauerne med en EC50 på 60±5 nmol/L og hæmmede (1) aggregering med en IC50 på 86±10 nmol/L og (2) calciumniveauerne med en IC50 på 104±8 nmol/L. Der blev ikke fundet nogen statistisk signifikante forskelle i bindings- og funktionsparametre 12, 60 og 108 timer efter koffeinudtagning (Tabel).

Gruppe 2 (400 mg/d i 2 uger)

Bindingsparametre afslørede en kontrol-Bmax-værdi på 110±3 fmol/mg protein og en KD-værdi på 1,21±0,09 nmol/L. Ved 12 og 60 timer efter koffeinudtagning steg receptortæthederne, Bmax, på begge tidspunkter med ca. 20%, men KD-værdierne var uændrede. Funktionelle eksperimenter afslørede, at adenosin A2A-receptoragonisten HE-NECA var betydeligt mere potent med hensyn til at øge cAMP i blodpladerne (dvs. EC50-værdierne var henholdsvis 45 % og 65 % mindre ved 12 og 60 timer efter koffeinudtagning end kontrolværdierne). En lignende tendens blev observeret i de IC50-værdier, der blev opnået i aggregationsforsøg og i målinger af cytoplasmatisk fri calciumkoncentration (Tabel).

Gruppe 3 (600 mg/d i 1 uge)

Samlet set opnåede vi data svarende til dem fra gruppe 2. SCH 58261 bandt til en enkelt affinitetsklasse af steder i trombocytmembraner fra kontroller med en Bmax på 100±4 fmol/mg protein og en KD på 1,27±0,09 nmol/L. Som vist i figur 1A, i membraner fra trombocytter høstet 1, 12, 60 og 108 timer efter koffeinudtagning, bandt radioliganden med den samme affinitet, men antallet af bindingssteder (Bmax) var signifikant (P<0,01) øget. I parallelle undersøgelser blev trombocytternes funktionelle respons på A2A-receptoragonisten HE-NECA bestemt. Som opsummeret i tabellen var HE-NECA’s potens til (1) at øge cAMP-dannelsen, (2) hæmme ADP-induceret trombocytaggregation og (3) sænke calciumniveauerne signifikant forøget i trombocytter, der blev opnået 12, 60 og 108 timer efter koffeinudtagning (figur 1B, 1C og 1D). Der blev også udført forsøg for at afgøre, om stigningen i tætheden af A2A-receptorer ville være ledsaget af et fald i ADP’s styrke og/eller effektivitet til at fremkalde aggregering. EC50-værdierne for ADP til stimulering af trombocytaggregation ved 12, 60 og 108 timer efter koffeinudtagning var henholdsvis 0,7 ± 0,2, 0,9 ± 0,1 og 0,8 ± 0,1 μmol/L, værdier, der ikke var signifikant forskellige fra værdierne 0,9 ± 0,1 μmol/L.2 μmol/L opnået i trombocytter fra kontroller (Figur 2).

Diskussion

Virkningerne af langtidsadministration af koffein hos mennesker og dyr og dets rolle i deres tolerance over for virkningerne af koffein er kontroversielle. Nogle undersøgelser, der viste en stigning af A1-receptorer i musehjernen, fandt beviser for en dosisafhængig opregulering af A1-receptorer ved koffein.23 Andre undersøgelser afslørede en opregulering af A2A-receptorer, hvilket tyder på en adaptiv effekt af koffeinindtagelse.24 Desuden kan kronisk koffeinindtagelse føre til en reduktion af trombocytaggregabiliteten som følge af opregulering af A2A-receptorer placeret på trombocytoverfladen14 , der spiller en potentiel rolle i patofysiologiske processer, såsom aggregation og trombogenese. Selv om sådanne ændringer kan bidrage til ændringer i trombocytfunktionen, ændrer tolerance over for koffein ikke denne xanthins styrke som en kompetitiv antagonist af adenosinets virkninger.25 Andre ændringer, såsom forskydning af receptoraffinitet til en tilstand med høj affinitet, ændringer i G-proteinniveauer eller koblingen af disse proteiner til adenosinreceptorer eller langvarig receptorbelægning kan være involveret i tolerancefænomenet.26 Der forekommer abstinenssymptomer på koffein hos mennesker; typisk er der tale om hovedpine, træthed, apati og døsighed.9 Især koffein øger plasmaadenosinkoncentrationen, og dens reduktion efter abstinens af antagonist tyder på receptormedieret regulering af plasmaadenosinkoncentrationen.27 Under iskæmi og/eller hypoxi har adenosin også neuroprotektive virkninger. I den voksne hjerne reducerer kronisk koffeinbehandling, som fører til opregulering af adenosinreceptorer, iskæmisk skade, mens akut eksponering (receptorantagonistisk virkning) øger iskæmisk skade.28

Det er blevet påvist, at kronisk indtagelse af koffein ændrer blodpladernes reaktion på adenosinvirkninger.14

Det er blevet påvist, at kronisk indtagelse af koffein ændrer blodpladernes reaktion på adenosinvirkninger.14 Gentagen indgivelse af koffein (750 mg/d i 1 uge) afslørede en stigning i A2A-receptortætheden, ledsaget af sensibilisering af trombocytresponser, såsom en stigning i cAMP-akkumulering og et fald i trombocytaggregation.15 Formålet med den foreliggende undersøgelse var at bestemme effekten af koffein-dosering og af indgivelsens varighed på bindings- og funktionsparametre. Derfor undersøgte vi ændringerne i tætheden og affiniteten af adenosin A2A-receptorer i humane trombocytmembraner hos personer, der blev behandlet med forskellige doser (400 eller 600 mg/d) i forskellige perioder med koffeinindtagelse (1 eller 2 uger). Specifikt undersøgte vi kontrolpersoner (før koffeinadministration) og koffeinbehandlede (1, 12, 60 og 108 timer efter den sidste dosis koffein).

Behandlingen med 400 mg/d koffein i 1 uge ændrede ikke A2A-receptorbinding og funktionelle parametre. Behandling med 400 mg/d i 2 uger eller 600 mg/d i 1 uge resulterede imidlertid i (1) en betydelig stigning (opregulering) af adenosin A2A-bindingssteder, (2) en stigning i cAMP-akkumulering, (3) en stigning i antiaggregatoriske virkninger og (4) et fald i calciumniveauer fremkaldt af A2A-receptoragonisten HE-NECA.

Opreguleringen af A2A-receptorer kan sandsynligvis tilskrives syntesen af nye receptorer under differentieringen af forstadieceller. Denne fortolkning er baseret på resultaterne af in vitro-forsøg, der viser, at inkubation af trombocytterigt plasma fra kontrolpersoner i en periode på 6 eller 12 timer med koffein eller SCH 58261 ikke påvirkede bindingsparametrene.15 Opreguleringen af adenosin A2A-receptorer forårsaget af kronisk indtagelse af koffein kan fortolkes som et tegn på, at endogent adenosin har en tonisk indflydelse på humane trombocytter, og at tilstedeværelsen af antagonisten opvejes af opreguleringen af A2A-receptorer. Hos voksne adsorberes koffein effektivt fra mave-tarmkanalen; de maksimale plasmakoncentrationer forekommer 15 til 120 minutter efter indtagelse, og halveringstiden for koffein er 2,5 til 4,5 timer7 . Den stigning af adenosin A2A-receptorer, der blev fundet 1 time efter den sidste dosis koffeinbehandling, svarede til den, der blev opnået 12 eller 60 timer efter koffeinudtagning, hvilket viser, at udtagningen ikke var nødvendig for opregulering af A2A-receptorer.

Et andet formål med den foreliggende undersøgelse var at bestemme, om ændringerne i bindingsparametre korrelerede med ændringer i funktionel(e) respons(er). Det blev fundet, at trombocytaggregation var forbundet med aktivering af adenylatcyklase og med en stigning i de intracellulære calciumkoncentrationer. HE-NECA’s potens 12, 60 og 108 timer efter koffeinafvænning var signifikant forøget sammenlignet med kontrolgruppen. Dette resultat indikerer, at gentagen indgivelse af forskellige doser koffein fører til betydelige ændringer i antallet af A2A-receptorer på trombocytoverfladen, ledsaget af en øget responsivitet over for receptorstimulering. Den klassiske adenosin A2A-receptor er ansvarlig for de antiaggregatoriske egenskaber af adenosin og dets analoger, hvilket er i overensstemmelse med observationen af, at aggregering er mere effektiv hos mus, der mangler A2A-receptorerne.8 Trombocytaggregation induceret af stigende koncentrationer af ADP var imidlertid ikke signifikant forskellig mellem kontrol- og koffeinbehandlede forsøgspersoner. En mulig forklaring på sidstnævnte observation er, at der ikke er nok adenosin i assaymediet til at frembringe et respons. Alternativt var omfanget af receptoropregulering (dvs. antallet af receptorer) hos de koffeinbehandlede forsøgspersoner ikke tilstrækkeligt til at fremkalde en forskydning af den ADP-inducerede aggregations-koncentrationsresponskurve. Når niveauerne af endogent adenosin stiger, som f.eks. under myokardiskæmi, stiger den ekstracellulære koncentration af adenosin imidlertid hurtigt til et niveau, der er tilstrækkeligt til at virke på opregulerede receptorer og kan have større trombocythæmmende virkninger end kontrol. Det er således muligt, at kronisk koffeinindtagelse i doser, der ikke ligger langt fra det gennemsnitlige kostindtag, kan føre til en paradoksal reduktion af trombocytaggregabiliteten under iskæmi.

Sammenlagt giver alle data yderligere beviser for, at kronisk indtagelse af koffein ændrer trombocytternes reaktion på adenosinets virkning. Det vigtigste resultat af denne undersøgelse er, at virkningerne af kronisk koffeinindtagelse på trombocytfunktionerne er afhængige af både dosis og varighed af behandlingen og ligger til grund for en reduktion af trombocytaggregabiliteten som følge af opregulering af adenosin A2A-receptorerne.

Fodnoter