Celler i det voksne menneskehjerte

Datarapportering

Ingen statistiske metoder blev anvendt til at forudbestemme stikprøvens størrelse. Eksperimenterne blev ikke randomiseret, og investigatorerne var ikke blinde for tildelingen under eksperimenterne og resultatvurderingen.

Forskningsetik for donorvæv

Hjertevæv (donorer D1-D7 og D11) blev behandlet på Wellcome Sanger Institute (Hinxton, UK) og blev indhentet fra afdøde transplantationsorgandonorer efter forskningsetisk godkendelse fra forskningsetisk komité (ref 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee) og informeret samtykke fra donorfamilierne. Hjertevæv (donorer H2-H7) blev bearbejdet på Harvard Medical School (Boston, Massachusetts, USA) og blev fremstillet fra afdøde organdonorer efter godkendelse fra Human Research Ethics Board (Human Research Ethics Board) Pro00011739 (University of Alberta, Edmonton, Canada). Der blev indhentet informeret samtykke fra donorfamilierne via det institutionelle Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE). Kardiovaskulær historie var ubemærket for alle donorer (Supplerende tabel 1).

Tvævsindsamling og behandling

Tvæv blev indhentet fra britiske og nordamerikanske donorer (D1-7 og 11, H2-7) efter kredsløbsdød (DCD) (D2, D4-D7 og D11) og efter hjernedød (DBD) (D1, D3, H2-H7). For britiske DCD-donorer åbnes brystkassen efter fem minutters stand-off og for DBD åbnes brystkassen, aorta afklemmes, og der udtages hjerteprøver. For nordamerikanske DBD-donorer afklemmes aortaen, kold cardioplegi (Celsior) indgives under tryk via aortaen for at standse slagtilstanden, hjertet udskæres, skylles i kold saltvand og prøverne udtages. Alle donorprøver var myokardbiopsier i fuld tykkelse fra venstre og højre atrium, venstre og højre ventrikel, interventrikulær septum og apex, med bevidst udelukkelse af store epikardiale fedtdepoter. Prøver, der blev anvendt til isolering af enkeltkerner, blev lynfrosset og opbevaret ved -80 °C. Isolering af enkeltceller og CD45+-berigelse blev udført på nyligt indsamlede prøver. Resterende væv efter kerne- og celleisoleringsprocedurer blev formalinfikseret eller frosset i OCT med henblik på yderligere undersøgelser.

Alle væv blev opbevaret og transporteret på is på alle tidspunkter indtil nedfrysning eller vævsdissociation for at minimere enhver transkriptionel nedbrydning. Tidligere undersøgelser af post mortem vævsstabilitet af GTEx-konsortiet på bulkvæv68 og i enkeltceller69 tyder på kun mindre ændringer i vævene inden for de første 24 timer post mortem, når de opbevares under kolde forhold.

Isolering af enkeltkerner

Enkelkerner blev opnået fra flash-frosset væv ved hjælp af mekanisk homogenisering som tidligere beskrevet70. Vævene blev homogeniseret ved hjælp af et 7 ml glas Dounce vævskværnssæt (Merck) med 8-10 slag med en løs pestel (A) og 8-10 slag med en stram pestel (B) i homogeniseringsbuffer (250 mM saccharose, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1× proteaseinhibitor, 0.4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1 % Triton X-100 i nucleasefrit vand). Homogenatet blev filtreret gennem en 40-μm cellefilter (Corning). Efter centrifugering (500 g, 5 min, 4 °C) blev supernatanten fjernet, og pellet blev resuspenderet i opbevaringsbuffer (1 × PBS, 4 % bovin serumalbumin (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn). Kerner blev farvet med NucBlue Live ReadyProbes-reagenser (ThermoFisher), og Hoechst-positive enkeltkerner blev oprenset ved fluorescerende aktiveret cellesortering (FACS) ved hjælp af influx, XDP eller FACSAria (BD Biosciences) (Supplerende figur 1). Kerneoprensning og integritet blev verificeret under et mikroskop, og kerner blev yderligere behandlet ved hjælp af Chromium Controller (10X Genomics) i henhold til producentens protokol.

Encellepræparering

Hjertevæv (0.2-0,9 g) blev overført fra kardioplegisk opløsning til blødeMACS C-rør (Miltenyi Biotec) indeholdende enzymatisk fordøjelsesbasisopløsning (100 μg ml-1 liberase TH Research grade og 50 μg ml-1 DNase I, HBSS 10 mM HEPES og 30 mM taurin)71. Vævene blev hakket med en saks (FST) og fordøjet automatisk ved hjælp af gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) med varmelegeme. Cardiomyocyt-depleteret enkeltcelle-suspension blev vasket med basisopløsning indeholdende 20 % føtal bovin serum (FBS) (Gibco), filtreret gennem 70-μm nylonfilter (BD Falcon), opsamlet ved centrifugering (330 g, 10 min, 4 °C) og resuspenderet i basisopløsning indeholdende 0,2 % FBS (Gibco). Cellerne blev manuelt optalt tre gange ved udelukkelse af Trypanblåt efter hver centrifugering og resuspenderet i en koncentration på mindst 2 × 106 ml-1. Enkeltceller blev behandlet ved hjælp af Chromium Controller (10X Genomics) i henhold til producentens protokol.

CD45+ celleberigelse

Celleopslæmning blev fremstillet som beskrevet ovenfor og efterfølgende mærket ved hjælp af anti-humane CD45 monoklonale antistofkonjugerede mikroperler i henhold til producentens protokol (Miltenyi Biotec). Kort fortalt blev op til 107 celler inkuberet i 15 minutter ved 4 °C i 80 μl PBS-, BSA- og EDTA-buffer (1× PBS pH 7,2, 0,5 % BSA, 2 mM EDTA) indeholdende 20 μl CD45-mikroperler. Celsuspensionen blev vasket i PBS, BSA, EDTA-buffer én gang og opsamlet ved centrifugering (330 g, 10 min., 4 °C). De resuspenderede celler blev påført MACS LS-kolonner (Miltenyi Biotec). CD45-depleteret cellefraktion blev kasseret efter tre vaske med PBS, BSA og EDTA-buffer, og CD45+ cellefraktionen blev opsamlet i PBS, BSA og EDTA-buffer ved at fjerne kolonnerne fra magnetfeltet. CD45+-celler blev talt og resuspenderet i PBS, BSA og EDTA-buffer til en koncentration på mindst 2 × 106 pr. ml før yderligere behandling ved hjælp af en Chromium Controller (10X Genomics) i henhold til producentens protokol.

Chromium 10X library preparation

Single celler og kerner blev talt manuelt ved Trypan blue exclusion eller automatisk ved hjælp af en Countess II (Life Technologies) ved hjælp af mindst to separate tællinger. Celle- eller kernesuspensionen blev justeret til 400-1 000 celler pr. mikroliter og indlæst på Chromium Controller (10X Genomics) med en målrettet celle- eller kernegenvinding på 4 000-10 000 pr. reaktion. 3′ genekspressionsbiblioteker blev fremstillet i overensstemmelse med producentens anvisninger for v2- eller v3 Chromium Single Cell Reagent Kits (10X Genomics). Kvalitetskontrol af cDNA og endelige biblioteker blev udført ved hjælp af Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) eller 4200 TapeStation System (Agilent). Bibliotekerne blev sekventeret ved hjælp af HiSeq 4000 (Illumina) på Wellcome Sanger Institute og NextSeq 500 (Illumina) på Harvard Medical School med en minimumsdybde på 20.000-30.000 læsepar pr. celle eller kerne (Supplerende tabel 22).

Spatial validering ved hjælp af smFISH med RNAscope-sonder

Ved forberedelse af formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) prøver blev frisk væv fikseret i neutralt bufferet 10 % formalin i 18-36 timer og efterfølgende indlejret i paraffinblokke. Fikserede frosne vævsprøver blev fikseret i 4 % paraformaldehyd (ThermoFisher). Sektioner blev skåret med en tykkelse på 5 μm ved hjælp af en mikrotom og anbragt på SuperFrost Plus-objekttræer (VWR). FFPE-vævsglas blev automatisk farvet ved hjælp af BOND RX (Leica) og RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) i henhold til producentens protokol. Fikserede frosne vævsglas blev behandlet i overensstemmelse med protokollen for RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio). RNAscope-klare eller specialfremstillede målprober blev kørt parallelt med multiplex positive og negative kontroller (Extended Data Fig. 12b, Supplerende tabel 23). Alle kerner blev DAPI-farvet. Alle FFPE-vævsslides blev afbildet ved hjælp af et Opera Phenix High-Content konfokalt screeningssystem (Perkin Elmer) med en z-trinsstørrelse på 1 μm og 20 × vanddæmpningsobjektiv (NA 0,16, 0,299 μm pr. pixel). Kanaler: Kanaler: DAPI (excitation 375 nm, emission 435-480 nm), Atto 425 (excitation 425 nm, emission 463-501 nm), opal 520 (excitation 488 nm, emission 500-550 nm), opal 570 (excitation 561 nm, emission 570-630 nm), opal 650 (excitation 640 nm, emission 650-760 nm). De fikserede frosne vævsprøver blev afbildet ved hjælp af et konfokalt mikroskop LSM710 (Zeiss) og et 40× oliedimmersionsobjektiv (1,3 olie, DIC III). Kanaler: Kanaler: DAPI (excitation 375 nm, emission 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (excitation 492 nm, emission 517 nm), Atto 550 (excitation 560 nm, emission 575 nm) og Atto 647 (excitation 649 nm, emission 662 nm). Visualisering og baggrundsfjernelse (rolling ball radius) blev udført ved hjælp af Fiji/ImageJ72. Der blev anvendt pseudofarver for bedre visualisering.

Haematoxylin- og eosinfarvning

Tvævprøver blev friskfrosset i isopentan (ThermoFisher) ved -80 °C og indlejret i OCT (VWR). Snittene blev skåret i en tykkelse på 10 μm ved hjælp af et mikrotom, placeret på SuperFrostPlus-objektiv (VWR) og yderligere behandlet i henhold til en standardprotokol for hæmatoxylin- og eosinfarvning (udvidede data fig. 12a).

Indsamling af skeletmuskelvæv

Intercostale muskelprøver blev udtaget fra mellem andet og tredje ribben på venstre side. Dette er typisk fra det dybeste lag af musklen (længst væk fra huden). Prøverne blev opsamlet direkte i den kolde konserveringsopløsning.

Kerneisolering for skeletmuskulatur

Muskelvæv blev vasket i 1× PBS, renset for eventuelle synlige fedtdepoter og hakket for at opnå fragmenter på ca. 1 mm3. Pr. prøve blev ca. 0,3 g hakket væv homogeniseret i 3 ml buffer A (250 mM saccharose, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1× proteaseinhibitor) ved hjælp af Dounce-vævemøllesæt (Merck) med 50 slag med den løse pestel (A). Homogenatet blev filtreret gennem en 100-μm cellefilter (Corning), og filteret blev skyllet med 1 ml og derefter 750 μl buffer A. Efter tilsætning af Triton X-100 (slutkoncentration 0,5 %) blev blandingen yderligere homogeniseret med 50 slag med den stramme pistil (B). Efter filtrering gennem en 40-μm si blev kerner centrifugeret (3 000 g, 5 min, 4 °C), resuspenderet i 1 ml buffer B (320 mM saccharose, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM magnesiumacetat, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1 × proteaseinhibitor, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) og oprenses ved hjælp af en 27 % Percoll-gradientopløsning. Percoll-blandingen blev centrifugeret ved 20 000 g (15 min., 4 °C), og pellet blev resuspenderet i 200 μl buffer B, efterfulgt af centrifugering (20 000 g, 3 min., 4 °C). Efter farvning med Trypan Blue blev de intakte kerner optalt ved hjælp af et hæmocytometer. Kerner blev profileret ved hjælp af en Chromium Controller (10X Genomics) i henhold til producentens protokol.

Encelleisolering for skeletmuskulatur

Muskelvæv blev vasket i 1× PBS, renset for synlige fedtdepoter og hakket fint. Derefter blev 2 g af det hakkede væv overført til fordøjelsesbuffer 1 (750 U ml-1 collagenase type 2 i 1× PBS) og inkuberet ved 37 °C i et vandbad i 90 minutter. Det delvist fordøjede væv blev opsamlet ved centrifugering (650 g, 5 min., 4 °C), og pellet blev resuspenderet i fordøjelsesbuffer 2 (100 U ml-1 collagenase type 2, 2 U ml-1 dispase i PBS). Efter 30 minutters inkubation ved 37 °C i et vandbad blev fordøjelsen stoppet ved tilsætning af 2 % FBS. Cellerne blev filtreret gennem en 100-μm- og en 40-μm-nylonsigte (BD Falcon), opsamlet ved centrifugering (650 g, 4 °C, 3 min) og vasket med 1× PBS, 2 % FBS. Derefter blev der anvendt en 20 % Percoll-gradient (15 000 g, 4 °C, 20 min) til celleoprensning. Det celleholdige lag blev opsamlet, vasket i PBS med 2 % FBS, og de levedygtige celler blev optalt ved udelukkelse af Trypanblå ved hjælp af et hæmocytometer. Kerner blev profileret ved hjælp af en Chromium Controller (10X Genomics) i henhold til producentens protokol.

Tabel over metodernes nøgleressourcer findes i Supplerende tabel 24.

Transkriptomkortlægning

Efter sekventering blev prøverne demultiplexet og gemt som CRAM-filer. Hver prøve blev kortlagt til det menneskelige referencegenom (GRCh38 v.3.0.0.0), der blev leveret af 10X Genomics, og ved hjælp af CellRanger-suite (v.3.0.1) med standardparametre. Enkeltcelleprøver blev kortlagt i forhold til referencen, som den blev leveret. Enkeltkerneprøver, referencen for pre-mRNA, blev oprettet ved hjælp af 10X Genomics’ instruktioner (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Tælle databehandling

Efter kortlægning blev prøver fra hver datakilde (enkeltkerne, enkeltcelle og CD45+-celle) grupperet i individuelle AnnData-objekter ved at sammenkæde raw_feature_bc_matrix_h5.h5.h5 og tilføje de relevante metadataoplysninger. For hvert datakildeobjekt blev gennemsnittet af unikke molekylære identifikatorer (UMI’er) (n_counts) beregnet og anvendt som tærskel for tomme dråber.

Detektion af doubletter

Efter fjernelse af tomme dråber anvendte vi scrublet73 til at tildele en doublet score (scrublet_score) til hver celle. Disse celler blev grupperet og visualiseret ved hjælp af UMAP-metoden74. Desuden blev hver celle behandlet til doublet-detektion ved hjælp af en perkolationsmetode for at muliggøre forbedret detektion af doublets75.

Cellekvalitetskontrol og filtrering

Hver datakilde blev behandlet og annoteret separat for at tage højde for kildespecifikke kvalitetsforskelle. Disse metrikker er medtaget som kovariater til yderligere behandling. Samlede celler og CD45+-celler blev filtreret for antal (500 < n_counts <15.000), gener (200 < n_genes), mitokondrielle gener (procent_mito <20%), ribosomale gener (procent_ribo <20%) og scrublet score (scrublet_score <0,3). Enkelte kerner blev filtreret for antal (500 < n_counts <15.000), gener (300 < n_genes <6.000), mitokondriegener (percent_mito <5%), ribosomale gener (percent_ribo <5%) og scrublet score (scrublet_score <0,3). De samme filtreringstærskelværdier blev anvendt på datasættet for skeletmuskulaturen.

Scanpy toolkit 1.576 i Python v.3.7 blev anvendt til at udføre downstream-analyser, herunder normalisering (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10.000), logtransformation (log1p), påvisning af variable gener (highly_variable_genes), regression af uønskede variationskilder (regress_out: n_counts og percent_mito), skalering af datafunktioner (scale: max_value = 10) og PCA (pca: using highly variable genes) som tidligere beskrevet77.

Batch alignment ved hjælp af deep variational autoencoder

Vi opbyggede en global manifold ved at tilpasse alle datakilder og donorer i vores data. Dette blev gjort i en procedure i tre trin: (1) Hver kilde blev analyseret og annoteret separat, idet der kun blev foretaget en justering for donorer ved hjælp af et lineært regressionstrin i pericyte-rummet før batchjustering med bbknn78. Differentielt udtrykte gener (DEG’er) blev beregnet ved hjælp af en Wilcoxon rank sum test med Bonferroni-Hochberg justering som implementeret i Scanpy-rammen. (2) For at annotere hver klynge brugte vi en integrativ tilgang ved at søge de mest signifikante DEG’er (P < 1 × 10-5) med en logFC >1 mod ToppFun79- og EnrichR80-databaserne. Signifikante hits på veje, transkriptionel regulering og biologiske processer blev prioriteret for at annotere en given klynge. Hvert cellekompartment blev mærket under adata.obs-slottet efter gruppering af kildespecifikke celletilstande. (3) Alle kilder blev kombineret i et enkelt AnnData-objekt under etiketten adata.obs. Batches blev justeret ved hjælp af batch_correction-funktionen fra scGen variational autoencoder81. Først justeres der for adata.obs, idet adata.obs anvendes som anker. Dernæst justerede vi for adata.obs, idet vi brugte adata.obs som anker. Hver batch alignment-runde blev kørt i 50 epochs.

Manifolds for adipocytter, vaskulære og immune hjertepopulationer samt skeletmuskelanalysen blev oprettet ved hjælp af denne metode, og clusteringnøjagtigheden blev evalueret med SCCAF82 (Extended Data Fig. 12d).

DEGs

For at hjælpe med annotationen af subpopulationerne i hvert cellekompartment beregnede vi DEGs ved hjælp af Wilcoxon rank sum-testen som implementeret i scanpy-arbejdsgangen og anbefalet af nyere benchmarkingundersøgelser83. Et gen blev anset for at være differentielt udtrykt, hvis det har en log2-transformeret foldændring > 1 og en P < 1 × 10-5, medmindre andet er angivet i analyseafsnittet.

Celle-celleinteraktioner

Ekspressionsmatricer for de undersøgte populationer blev eksporteret fra AnnData sammen med en metadatatabel, der indeholdt celle-barkoderne som indekser. Vi kørte derefter CellPhoneDB som følger: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. CellPhoneDB rå forudsigelser blev filtreret ved at fjerne de interaktioner med en P > 1,0 × 10-5. Signifikante par blev derefter indsendt til gensætberigelsesanalyse i ReactomeDB, enrichR og ToppFun med henblik på funktionel klassificering. De vaskulære celler blev tilfældigt underudtaget til 39.000 celler før analysen, og hjertereparationsgruppen (atriale og ventrikulære kardiomyocytter, FB’er og immunceller) blev tilfældigt underudtaget til 69.295 celler før analysen.

Visualisering af genekspression på 10X Genomics Visium-data

Vi behandlede de offentligt tilgængelige Visium-data for venstre ventrikulært myokardie fra 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) ved hjælp af Scanpy v.1.5 arbejdsgang, der er tilpasset til analyse af 10X Genomics Visium-data (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). Kort fortalt blev pletter fjernet med mindre end 500 UMI’er eller mere end 20.000 UMI’er og mindre end 200 gener. Data blev log-transformeret og normaliseret før plottet.

Vurdering af RNA-hastighed

For at beregne RNA-hastigheden for de enkelte celler og CD45+ berigede enkeltceller brugte vi CellRanger output BAM-filen og GENCODE v33 GTF-filen (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) sammen med velocyto84 CLI v.0.17.17 til at generere en loom-fil, der indeholder kvantificering af splejset og usplejset RNA. Derefter byggede vi en manifold, clusterede cellerne og visualiserede RNA-hastighederne ved hjælp af scVelo85.

Subpopulationsanalyser af atriale og ventrikulære kardiomyocytter, FB’er og neuronale celler

Alle stregkoder mærket i det globale objekt som kardiomyocytter, fibroblaster og neuronale celler blev udvalgt til yderligere subpopulationsanalyser. Yderligere cellepopulationsspecifikke filtreringskriterier blev anvendt på kerner som følger: antal kardiomyocytter (n_counts <12.500), gener (n_genes <4.000), mitokondriegener (percent_mito <1%), ribosomale gener (percent_ribo <1%) og scrublet score (scrublet_score <0.25); FB mitokondrielle gener (percent_mito <1%), ribosomale gener (percent_ribo <1%); neuronale cellegener (n_genes <4000), mitokondrielle gener (percent_mito <1%), ribosomale gener (percent_ribo <1%). Samlede celler og CD45+-celler blev udelukket i datasættene for atriale og ventrikulære kardiomyocytter og bidrog ikke til subpopulationsanalysen. Der blev ikke anvendt yderligere filtrering af FB’er eller neuronale celletotal og CD45+-celler. Kardiomyocytter og FB’er blev derefter yderligere opdelt i to grupperinger baseret på oprindelsesregionen: (1) venstre og højre atrium og (2) venstre og højre ventrikel, apex og interventrikulær septum.

Donoreffekter blev justeret som beskrevet i trin (1) ovenfor. For FB og neuronale celler blev kilderne justeret som beskrevet i trin (3) ovenfor. Leiden clustering og UMAP-visualisering blev udført til identifikation af subpopulationer og visualisering86. Differentielt udtrykte gener blev beregnet ved hjælp af Wilcoxon rank sum test. Gener blev rangeret efter score.

Tværvævssammenligning af hjertets immunpopulationer med skeletmuskel-, nyre- og blodimmunpopulationer

Vi indsamlede enkeltcelletranskriptomdata for voksne nyrer fra ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/), og undergrupperede alle immunceller rapporteret i deres undersøgelse. For SKM udvalgte vi de annoterede immunceller fra den sammenlagte manifold. For det menneskelige blod anvendte vi det offentligt tilgængelige datasæt med 10 000 enkelte PBMC-celler fra 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3). Som tidligere beskrevet87 trænede vi en logistisk regressionsmodel på de kardiale immunceller ved hjælp af 80 % af ekspressionsdataene og testede dens nøjagtighed på de resterende 20 % for at producere en model med en nøjagtighed på 0,6862 (Udvidede data Fig. 8f, Supplerende tabel 16). Vi anvendte derefter denne model til at forudsige analoge kardiale immunpopulationer i den voksne nyre, SKM og PBMC’er. Forudsigelser med en sandsynlighed på mindre end 0,8 blev udelukket fra nedstrøms sammenlignende analyser.

Gene Ontologi berigelsesanalyse

For den ventrikulære kardiomyocytpopulation brugte vi R-pakken gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) med den score-rangerede genliste for vCM4 som input og sættet af gener udtrykt i ventrikulære kardiomyocytter som baggrund (de gener, der har et UMI-tal >1). For at udføre Gene Ontology-analysen på de vaskulære celler blev de 500 vigtigste signifikante DEG’er (P < 1 × 10-5) med en log-transformeret foldændring > 1 søgt mod Gene Ontology-databasen for biologiske processer ved hjælp af ToppFun79 (Supplerende tabel 25). De fem øverste signifikant berigede termer (q < 0,05) for hver subpopulation blev udvalgt og plottet på et varmekort. For at udføre vejanalysen på adipocytterne blev de 500 vigtigste signifikante DEG’er (P < 1 × 10-5) med en log-transformeret foldændring > 0,5 søgt mod ToppFun79 vejdatabaser (Supplerende tabel 26). De fem øverste signifikant berigede veje (q < 0.05) for hver subpopulation blev udvalgt og plottet på et varmekort.

Gensæt score

Vi bruger funktionen score_genes som implementeret i scanpy til at beregne berigelsen af gener, der er involveret i Oncostatin M-stien. En liste over gener blev indsamlet efter litteratursøgning88,89. Ved berigelse af gensæt blev kun højt udtrykte gener taget i betragtning for at reducere støj (mere end 500 UMI’er på tværs af alle celler). Den samme analyse blev udført til sammenligning af kardiale immunceller i vores undersøgelse med observationer fra tidligere undersøgelser af kardiale residente makrofager51, vævsremodellerende makrofager i musen45 og æggeblommesækkens lineageoprindelse90.

Statistik og reproducerbarhed

Alle analyser blev udført ved hjælp af R Software, v.3.6.1. Student’s t-tests blev anvendt til at sammenligne celletypefordelinger på hvert sted. P < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Lineære regressionsmodeller (korrelationer) blev opnået ved hjælp af R-funktionen lineær model (lm), som estimerer den statistiske sandsynlighed (P-værdi) for en lineær sammenhæng. Bonferroni-korrektion blev anvendt til multipel testning.

De afbildede RNAscope-mikrografer i figurerne er repræsentative. Mikrograferne i fig. 2g, 3c, h og udvidede data fig. 3c (HAMP), udvidede data fig. 3e (CNN1), udvidede data fig. 4g, m, 6f blev gentaget med lignende resultater i to individuelle vævsafsnit. Mikrograferne i fig. 2h, 3f og Extended Data Fig. 3c (CNN1), Extended Data Fig. 3e (PCDH7), Extended Data Fig. 6e, h, 9d blev gentaget med lignende resultater i tre individuelle vævsafsnit. Mikrograferne i fig. 1e, 2d, 3e og Extended Data fig. 1f, 3c (FHL1) og Extended Data fig. 6d blev gentaget med lignende resultater i fire individuelle vævsafsnit. Mikrograferne i fig. 2c og Extended Data fig. 3c (PRELID2), Extended Data fig. 10e, 12a blev gentaget med lignende resultater i seks eller flere individuelle vævsafsnit. Positive og negative kontroller blev udført én gang pr. anvendt prøve.

GWAS-berigelsesanalyse

Vi hentede GWAS-sammenfatningsstatistikker fra broad cvdi, EBI GWAS-kataloget og GWAS-atlas. Vi udvalgte egenskaber med GWAS med god effekt (n > 5.000 og antal signifikante loci >10). GWAS-datasæt er opsummeret i supplerende tabel 27. Genekspressionsdata for proteinkodende gener blev kortlagt på Entrez-gen-id’er, og disse genannotationer blev anvendt på den menneskelige genomsamling hg19/37. Vi anvendte kun genekspressionsdata fra kerner. Vi implementerede den tidligere beskrevne analyse64 i python og i R. De log-transformerede tællinger (plus en pseudotælling) blev brugt til at beregne gennemsnitlige celletype-specifikke ekspressionsprofiler. Vi udførte individuelle magma-analyser for hver celletype, idet vi altid betingede os standardkovariater på genniveau (f.eks. genlængde) og gennemsnitlig genekspression på tværs af alle celler. Efterfølgende anvendte vi Benjamini-Hochberg-metoden og udvalgte celletypeegenskabsassociationer med FDR < 10%. Disse par blev derefter underkastet betinget analyse som tidligere beskrevet64 for at definere “uafhængige”, “fælles forklarede” og “delvist fælles forklarede” par af associationer (Supplerende tabel 28).

Fordelinger af spredte celler og isolerede kerner

De forskellige procedurer for opnåelse af isolerede kerner og spredte celler resulterede i signifikant forskellige fordelinger af celletyper (Supplerende tabel 29, Udvidede data Fig. 2). Især blev 30.1% og 49.2% af isolerede kerner afledt af atriale og ventrikulære kardiomyocytter i de atriale og ventrikulære regioner, mens disse celler for det meste blev udelukket fra præparater af isolerede og CD45-selekterede celler (Supplerende tabel 2).

Hvis man udelukker kardiomyocytter, forblev fordelingen af celletyper identificeret fra isolerede kerner og spredte celler forskellig (Supplerende tabel 30). Selv om 59,0 % af de spredte celler var EC’er, var kun 15,7 % af kernerne afledt af EC’er. I modsætning hertil var 64,2 % af kernerne fra FB’er (31,2 %) og pericytter (33,0 %), mens kun 17,1 % af de spredte celler var FB’er (2,3 %) og pericytter (14,8 %). Disse forskelle kan afspejle følsomhed af EC-kerner over for isoleringsprocedurer eller modstandsdygtighed af pericytter og FB’er over for enzymatisk fordøjelse af cellerne.

Trods forskelle i cellefordelingen mellem isolerede kerner og spredte celler var genekspressionsprofilerne for cellelinjerne rimeligt korreleret (r > 0,4 for hver celletype). For at behandle overensstemmelsen af de gener, der er fanget af celler og kerner, sammenlignede vi udtrykket af de vigtigste celletypemarkører fra Fig. 1c på tværs af de tre kilder (udvidede data Fig. 1c). Da kerner mangler cytoplasmatisk RNA, var ekspressionen af visse gener, især immungenerne NKG7 og C1QA, lavere i kerner end i celler. Ikke desto mindre var den generelle tendens med hensyn til markørgener konsistent på tværs af de tre kilder, og de samme gener adskilte individuelle celletyper uafhængigt af kilden.

Nærmere analyse af vaskulære celler

PC3_str indeholdt et lignende bidrag af celler og kerner og havde en scrublet-score under den anvendte strenge tærskelværdi; ikke desto mindre var det gennemsnitlige antal gener og tællinger i denne klynge højere end gennemsnittet. På trods af vores strenge kvalitetsfiltrering kan vi således ikke udelukke muligheden for, at der kan være doubletter i denne klynge. EC10_CMC-like og PC4_CMC-like samudtrykker EC- eller pericytegener med kardiomyocytmarkører, og der er behov for yderligere undersøgelser for at forstå, om de repræsenterer tidligere ukendte celletilstande eller doubletter.

Observationerne af de arterielle og venøse SMC understøttes af tidligere undersøgelser, der forudsiger, at arterielle SMC’er er mere kontraktile, og venøse SMC’er er mindre differentierede91.

EC3_cap beriger for transkripter, der koder for komponenter af AP1 (JUN og FOS), som medierer flere EC-skæbnebeslutninger, herunder respons på VEGF, inflammatoriske og stresssignaler, og ATF3, et adaptivt responsgen, der induceres af forskellige signaler92,93,94.

Skeletmuskelkarakterisering

Vi indsamlede intercostale skeletmuskelprøver fra fem raske personer, herunder en donor med matchende hjertevæv, og profilerede transkriptomet af 35.665 enkeltceller og 39.597 enkeltkerner. Analogt til hjertet gjorde kombinationen af celler og kerner det muligt for os at fange og opløse større cellelinjer, herunder kardiomyocytter, fibroblaster, endotelceller, glatte muskelceller, pericytter, myeloide og lymfoide immunceller og satellitceller (Udvidede data Fig. 11a, b, Supplerende tabel 31).

En yderligere analyse af skeletmusklens vaskulære celler identificerede ti forskellige populationer. Endothelcellerne viste fem klynger adskilt på grundlag af deres respektive vaskulære senge med signaturer, der ligner dem, vi observerer i hjertet. EC_cap udtrykker VWF og RGCC. Venøs EC_ven udtrykker ACKR1 og PLVAP, mens arteriel EC_art viser SEMA3G og HEY1, i overensstemmelse med vores hjertedata (Extended Data Fig. 11c, d, Supplementary Table 32).

De overordnede fordelinger af vaskulære og stromale cellepopulationer i skelet- og hjertemuskel var ens, herunder de arterielle og venøse træk af EC’er; dog; skeletmusklen indeholdt en enkelt SMC-klynge, potentielt relateret til den mindre størrelse af datasættet. I skeletmuskulaturen omfattede de forudsagte celle-celle-interaktioner mellem EC_art og SMC’er NOTCH1/4-JAG1 samt JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, men ikke JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, der blev udledt i hjertet (Udvidede data fig. 11e, f, Supplerende tabel 33).

Hjerteimmunceller

Ved anvendelse af den logistiske regressionsmodel identificerede vi ikke nogen modstykke til de kardiale IL17RA+ monocytter i SKM eller nyre, muligvis på grund af den lille størrelse af denne population.

Naive T-celler (CD4+T_naive) identificeret udtrykte CCR7 og SELL, hvilket indikerer deres naive og vævsresidente natur95. Hukommelses-T-celler (CD8+T_tem) udtrykte BACH2, STAT4 og IL7R, der er forbundet med langvarig immunhukommelse96,97. Vi karakteriserede yderligere de lymfoide celler ved hjælp af scNym98 og trænede det ved hjælp af offentliggjorte data99,100. Den resulterende model blev anvendt på vores hjerteimmunceller, og de celler med en forudsagt score på over 0,8 blev anset for at være sandsynlige kandidater til re-annotering. Ved hjælp af denne fremgangsmåde identificerede vi kandidater for plasma-B-celler (109), dendritiske celler (645), medfødte lymfoide celler (89), MAIT T-celler (219), T-hjælperceller (80), T-regulatoriske celler (11), centrale T-hukommelsesceller (103), γδ T-celler (30) og plasmocytoide dendritiske celler (27). Disse annotationer kan findes i annotationerne til hjerteimmunobjekter under etiketten ‘scNym’ på www.heartcellatlas.org.

Rapporteringsresumé

Der findes yderligere oplysninger om forskningsdesign i Nature Research Reporting Summary, der er knyttet til denne artikel.