2 Fysiologiske beviser for endozepiner
Syntesen af RO 15-1788 (eller flumazenil, FLZ), den første kendte BZ-antagonist (Hunkeler et al., 1981; Ramerstorfer, Furtmüller, Vogel, Huck, & Sieghart, 2010), lettede en stor mængde forskning, der støtter hypotesen om, at der findes endogene ligander til BZ-bindingsstedet, og at de er funktionelt relevante in vitro og in vivo. Selv om FLZ har været et værdifuldt redskab til identifikation af fysiologiske BZ-aktioner, har dets anvendelse til dette formål begrænsninger. Det er f.eks. blevet vist, at FLZ kan udøve PAM-effekter i heterologisk udtrykte GABAARs, især ved høje koncentrationer (Ramerstorfer et al., 2010). Det er vigtigt, at FLZ aldrig er blevet vist at have NAM-effekter på heterologisk udtrykte GABAARs, hvilket tyder på, at eventuelle NAM-effekter af FLZ på GABA-medieret hæmning højst sandsynligt skyldes antagonisme af en endogen ligand.
In vitro-undersøgelser har antydet en række kredsløb, hvor endozepiner er konstitutivt udtrykt og fysiologisk aktive, hvilket fremgår af undertrykkende virkninger af FLZ på GABA-medieret hæmning, hovedsagelig gennem et fald i responsvarigheden. F.eks. undertrykker FLZ IPSP(C)s i hippocampus (King, Knox, Dingledine, 1985; Krespan, Springfield, Haas, & Geller, 1984) og i neokortikale neuronale kulturer (Vicini et al., 1986). FLZ har vist sig at undertrykke hæmning i dentate gyrus granuleceller i pilocarpinmodellen af temporallappeepilepsi (Leroy, Poisbeau, Keller, & Nehlig, 2004) og at undertrykke hæmning i lag II/III neokortikale pyramidale neuroner (Ali & Thomson, 2008). Langtidspotentiering af inhiberende synapser i hippocampal CA1-området var forbundet med en stigning i IPSC-amplitude, der blev undertrykt af FLZ (Xu & Sastry, 2005). Senest er det blevet vist, at FLZ undertrykker synaptiske hæmningsneuroner i den thalamiske retikulære kerne (nRt, Christian et al., 2013), hvilket indikerer tilstedeværelsen af et endozepin i denne kerne. Tilsammen understøtter disse undersøgelser med FLZ stærkt tilstedeværelsen af endogen PAM-aktivitet i flere forskellige hjerneområder, hvilket indikerer, at dette er en bredt implementeret endogen modulatorisk mekanisme i CNS.
En række interessante kliniske fund er i overensstemmelse med FLZ-antagonisme af endozepinfunktion. For eksempel kan FLZ-behandling fremkalde panikanfald hos patienter med panikforstyrrelse, men ikke hos raske kontroller (Nutt, Glue, Lawson, & Wilson, 1990). Det kan også fremskynde større panikreaktion hos kvinder med præmenstruel dysphorisk lidelse sammenlignet med kontroller (Le Mellédo, Van Driel, Coupland, Lott, & Jhangri, 2000) og for at vende stupor forbundet med hepatisk encephalopati (Als-Nielsen, Gluud, & Gluud, 2004; Baraldi et al., 2009). Tilsammen tyder disse undersøgelser på en fysiologisk rolle for en ophobning af endozepiner i det ekstracellulære rum, dvs. en fysiologisk ophobning, i reguleringen af angst/panik. Desuden blev det rapporteret, at serumniveauer af stoffer, der hæmmer FLZ-binding til cerebellære membraner hos rotter, steg to gange under fødsel ved spontan fødsel, en effekt, der ikke blev set hos patienter, der gennemgik kejsersnit (Facchinetti, Avallone, Modugno, & Baraldi, 2006), hvilket tyder på, at fysiologiske tilstande såsom fødsel kan forårsage endozepinopbygning.
Relevansen af disse resultater for menneskelige epilepsipatienter er i øjeblikket stadig ukendt, da beviserne for endozepinvirkninger hos epilepsipatienter ikke er entydige. FLZ kan fremkalde anfald hos patienter, men i det mindste nogle patienter modtog sandsynligvis BZ-behandling (Spivey, 1992). For eksempel blev der i en serie på 67 patienter, der blev evalueret forud for epilepsioperation (Schulze-Bonhage & Elger, 2000), fremkaldt anfald hos 8 (12%)-alle var tidligere blevet behandlet med BZ’er. Caserapporter tyder på forværring af anfald ved FLZ hos spædbørn og hos ældre (McDuffee & Tobias, 1995; Thomas, Lebrun, & Chatel, 1993). De rapporterede virkninger af FLZ på kramper i dyreforsøg er også blandede. Hos rotter, der er yngre end 2 uger, forværrer FLZ mindre motoriske anfald induceret af PTZ (Rathouská, Kubová, Mares, & Vorlícek, 1993). Især i højdosis krampemodeller er der rapporteret om enten undertrykkelse af anfaldsaktivitet (Kaijima, Le Gal La Salle, & Rossier, 1983) eller ingen virkning (Hunkeler et al., 1981). I GAERS-modellen af genetisk spontan fraværsepilepsi havde FLZ koncentrationsafhængige virkninger, idet lave doser undertrykte spike-bølgeudladninger (SWD’er) og højere doser forstærkede dem (Marescaux et al., 1984). Desuden blev det vist, at en genetisk mutation (R43Q) i den humane γ2-underenhed, der er forbundet med både familiært fravær og feberkramper, ophæver (Wallace et al., 2001) eller reducerer (Bowser et al., 2002) in vitro følsomheden af specifikke GABAARs over for DZP (Wallace et al., 2001) eller reducerer (Bowser et al., 2002). Mekanismen for øget anfaldsaktivitet i forbindelse med receptorens ufølsomhed over for DZP, en eksogen ligand, er endnu ikke kendt. En provokerende hypotese er, at mutationen gør receptorerne ufølsomme over for et naturligt forekommende endogent BZ. Da et endogent BZ sandsynligvis ville have anfaldsbekæmpende egenskaber, ville mutationer i receptoren, som forhindrer binding af det endogene BZ, forventes at forårsage anfald. Imidlertid er receptortrafikken også påvirket af denne mutation (Kang & Macdonald, 2004; Sancar & Czajkowski, 2004) og kunne bidrage til anfaldsaktiviteten, så endozepiners rolle i anfald i forbindelse med γ2R43Q-mutationen er fortsat kontroversiel.
FLZ er også blevet rapporteret til at vende idiopatisk tilbagevendende stupor (Rothstein et al, 1992), selv om det i de senere år er blevet klart, at i det mindste nogle patienter, der reagerede på FLZ, havde skjult brug af BZ (Granot, Berkovic, Patterson, Hopwood, & Mackenzie, 2004), og dette område er fortsat kontroversielt (Cortelli et al., 2005). I en nyere undersøgelse normaliserede FLZ årvågenhed i en velkarakteriseret gruppe af patienter med hypersomni. En peptidergisk PAM-aktivitet blev fundet i cerebrospinalvæske (CSF) hos disse patienter (Rye et al., 2012). PAM interagerede imidlertid ikke med en potentiering af BZ midazolam og var delvis vedvarende i α1(H101R), GABAARs med en punktmutation, der gør dem BZ ufølsomme, hvilket indikerer, at det måske ikke er et klassisk BZ-mimicerende middel (Rye et al., 2012). Identiteten af denne CSF PAM og dens rolle i patofysiologien af hypersomni er fortsat ukendt.