Immunopathology of highly virulent pathogens: insights from Ebola virus

Ebola virusはフィロウイルス科に属する包囲型陰性鎖RNAウイルスで、ヒトやヒト以外の霊長類に重度の出血熱症候群を誘発するウイルスグループである。 このウイルスは、1976年にアフリカのザイール（現コンゴ民主共和国）のエボラ川流域で発生した集団感染で初めて認識されました。 同年末には、スーダンで、別種ではあるが近縁のウイルスによる2回目の流行が発生した1,2。 アフリカ中央部で発見されて以来、過去30年間に数回の発生が繰り返され、現在もコンゴ民主共和国（http://www.who.int/csr/don/2007_09_11/en/index.html）で発生が確認されています（2007年9月11日）。 自然界におけるウイルスの貯蔵庫や中間宿主の範囲は十分に解明されていませんが、最近の研究では、フルーツコウモリがエボラウイルスの複製を支持している可能性があることが判明し、これらの動物がウイルスのライフサイクルに関与している可能性が示唆されています3。

ヒトへの感染は通常、死亡または感染した人や野生動物のウイルスに直接接触した後に起こり、その後人から人へ感染する。 フィロウイルスは、粘膜表面や皮膚の擦り傷、あるいは汚染された注射針の使用によって体内に侵入する4（図1a）。 エボラウイルスによる発病は突然で、潜伏期間は4〜10日である。 患者は、まず発熱、悪寒、倦怠感、筋肉痛、頭痛などの非特異的なインフルエンザ様症状を示す。 腹痛、吐き気、嘔吐が続き、咳、咽頭痛、下痢が見られることもあります。 5日目頃に発疹が出ることが多く、フィロウイルス感染症に特徴的な症状です。 ウイルスの複製が広範囲に及ぶため、全身、消化器、呼吸器、血管、神経症状が現れ、肝臓、脾臓、腎臓、生殖腺など多くの臓器で壊死が認められます5。 末期には、肝臓の炎症と障害、組織の破壊、血管透過性の上昇をもたらす内皮バリア機能の破綻により、播種性血管内凝固などの凝固障害、体液分布障害、低血圧、出血が特徴的である。 致死的なケースでは、多臓器不全と重度の敗血症性ショックに類似した症候群の発症の結果、通常感染後7日から16日の間に死亡します6。 現在、感染を治療する抗ウイルス薬はなく、より毒性の強いザイール種とスーダン種のウイルスの死亡率は40～90％です7。

致命的なエボラ感染に対する宿主免疫応答

エボラウイルスの制御できないウイルス複製は、その細胞死効果および宿主免疫応答の顕著な調節不全を誘発するので、その病原体の中心をなしている。 ウイルスによる免疫系の障害は、様々なメカニズムで発生する。 モルモットと同様に非ヒト霊長類における研究により、単球、マクロファージ、樹状細胞がウイルス複製の早期かつ優先的な場所である可能性が指摘されている8,9が、ウイルスが生体内で活発に複製するのではなく、レクチン受容体に結合してこれらの細胞上に存在するという可能性も残されている。 これらの細胞は、リンパ管を通じてウイルスを輸送するためのビークルとして機能していることが示唆されている10。 さらにウイルスの複製が進み、他の臓器や組織への全身的な拡散が起こる（図1b）。 単球やマクロファージが感染すると、腫瘍壊死因子、インターロイキン-1β、マクロファージ炎症性タンパク質-1α、活性酸素・窒素種などの炎症性サイトカインやケモカインが放出される11,12。 これらのメディエーターの発現は、より多くの単球やマクロファージを感染部位に引き寄せると考えられ、好中球も引き寄せる可能性がある。 最近のデータでは、生産的な感染はしていないが、in vitroでフィロウイルスを処理したヒト好中球は、骨髄系細胞に発現するトリガー受容体-1（TREM-1）の急速な活性化を示す13。この結果、さらに炎症性サイトカインやケモカインが放出され、血管拡張や血管透過性の上昇に寄与していることが示唆されている。 さらに、感染した単球やマクロファージは、細胞表面に組織因子を発現し、凝固異常症の発症に関与している可能性がある14。 感染後、マクロファージは大量に細胞溶解とアポトーシスを起こすため15、活性化した単球やマクロファージはウイルスの拡散を抑制することはできないようである。 したがって、活性化した単球やマクロファージは、ウイルスの拡散を阻止するのではなく、ウイルスの複製を支援したり、細胞表面のレクチン結合タンパク質と結合したウイルスをリンパ系に輸送したりして、播種に寄与している可能性がある。 単球やマクロファージと同様に、未熟な樹状細胞（DC）もエボラウイルスの「標的」であり、DCが発現するC型レクチンDC-SIGNとの相互作用によりウイルス粒子が付着するか、他のDC発現細胞表面受容体との相互作用により感染する（図1c）。 樹状細胞は、免疫系で最も効果的な抗原提示細胞の一つであり、多くの病原体に対する自然免疫反応と適応免疫反応をつなぐ重要なインターロイキンやサイトカインを分泌する。エボラウイルスに感染したDCは、これらの重要な機能に重大な障害をもたらしている。 例えば、in vitroで生きたウイルスに感染したヒト骨髄系DCは、通常の炎症性サイトカインとコスティミュレーション分子のプロファイルを分泌することができない。 これらの細胞は成熟または活性化せず、主要組織適合性複合体（MHC）分子をアップレギュレートすることができないため、T細胞を刺激することができない16,17。 一方、非感染性エボラウイルス様粒子（VLP）を処理すると、DCが活性化され、強固な炎症反応を引き起こす18。この効果は、エンベロープ糖タンパク質のムチン様ドメインに依存している19。 生ウイルスや不活性化ウイルスではDCの機能が抑制されるが、VLPでは抑制されないことから、DCの機能と成熟の抑制は、VLPには存在しないウイルスタンパク質やゲノム物質の存在によるものと思われる。 エボラウイルス感染がDCの他の亜集団、特に抗ウイルスインターフェロン反応に重要な形質細胞系DCに及ぼす有害な影響を明らかにするためには、さらなる研究が必要である。 非機能的なDCの結果には、体液性または細胞媒介性免疫応答を刺激する能力の低下が含まれ、これがウイルス複製の制御の欠如に寄与している可能性がある。

自然免疫機能に対する阻害効果の主要な決定要因は、インターフェロンの抗ウイルス効果に対するエボラウイルスの耐性であり、これはウイルス自体による重要なインターフェロン応答経路の中断によるものと考えられる20,21,22; インターフェロンの産生は、マクロファージ、末梢血単核細胞およびDCにおいてin vitroおよびin vivoでエボラウイルス感染により阻害されている16,23. また、エボラウイルス感染細胞では、I型インターフェロン反応に重要なインターフェロン刺激遺伝子の発現が低下している20,22,24。 また、マウスでは、インターフェロン応答が病気の転帰に非常に重要であることが示されている。 免疫不全マウスはエボラウイルス感染に抵抗性であるが、インターフェロンα/β受容体やシグナル・トランスデューサー・アクチベーター1（STAT1）を持たないマウスやインターフェロンに対する抗体で処理したマウスは発病しやすくなることから25、インターフェロンが非感染細胞の保護に重要な役割を果たすことが浮き彫りになっている。 エボラウイルスがインターフェロン反応に抵抗するメカニズムは、いくつか確認されている。 他のいくつかのウイルスと同様に、エボラはインターフェロン反応に拮抗する特定のウイルス・タンパク質をコードしている。 2つのウイルスにコードされたタンパク質、VP24とVP35は、インターフェロン反応の誘導を妨害することが示されている26,27,28。 STAT1 の核内蓄積は VP24 によって妨げられ、I 型インターフェロンのシグナル伝達がブロックされ、感染細胞はこの抗ウイルス反応に対して鈍感になる27。 エボラ出血熱の VP35 は、インターフェロン制御因子 3 (IRF-3) の活性をブロックし、インターフェロン応答を低下させる26,28。 さらに最近、VP35 は二本鎖 RNA 依存性プロテインキナーゼ (PKR) の活性を阻害することが示された29。 これらの研究を総合すると、ウイルスによるインターフェロン経路の阻害は、インターフェロン刺激遺伝子の転写を減少させて抗ウイルス反応状態を防ぐだけでなく、成熟および活性化した骨髄系DCの数の減少に寄与し、その結果、適応免疫反応の活性化を妨げていることが示唆された。 適応免疫は、機能的なDCや他の重要な抗原提示細胞の欠如だけでなく、感染したヒトや非ヒト霊長類ではリンパ球が大規模なアポトーシスを起こすため、著しく損なわれている15,30,31。 リンパ球はウイルスの標的ではないが、B細胞を除く相当数の細胞が病気の間にアポトーシスを起こす32; その結果、CD4+およびCD8+ T細胞の数は、死亡する前にヒトおよび非ヒト霊長類の致命的感染で大幅に減少する30,31,33。 リンパ球のアポトーシスは、他のウイルス性出血熱の一般的な症状でもあり、敗血症性ショック時に頻繁に観察される34。

試験管内のリンパ球の研究では、アポトーシスの引き金に関わるいくつかの分子（TRAIL および Fas-FasL15 など）がこれらの細胞集団に存在することが示されている。 しかし、この「バイスタンダー」アポトーシスを引き起こすメカニズムはまだ研究中である。 感染マクロファージが分泌するアポトーシス促進可溶性因子である一酸化窒素（NO）などの炎症性メディエーターやその他の因子が、観察されたリンパ球のアポトーシスを誘導することが可能なのかもしれない。 あるいは、DCの機能低下や全体的な免疫抑制状態が、この現象に寄与している可能性もある31。 さらに別の可能性としては、リンパ球とエボラウイルスまたは可溶性遺伝子産物との直接的な相互作用によって、細胞死が積極的に引き起こされていることが考えられる。 自然免疫系の細胞および／または迅速な適応抗体反応を含む早期反応の重要性は、曝露後のワクチン投与により非ヒト霊長類を保護した最近の研究によって強調されている35。 致死例と非致死例の免疫反応の違いを明らかにすることは、今後の効果的な治療法やワクチンの開発にとって重要である。 エボラウイルス感染症では、死亡例と回復例で、臨床症状や免疫反応に特異的な違いがあることが指摘されている（表1）。 この比較から、抗原特異的な細胞媒介免疫反応の発現が、ウイルスのクリアランスと相関していることが明らかである。 ワクチン接種を受けた非ヒト霊長類が、エボラウイルス感染チャレンジから生還し、抗原特異的な細胞性免疫応答を示した研究36,37,38 は、この知見を裏付けている。 さらに、致死的なエボラウイルス感染に挑戦したマウスでは、体液性および CD8+ T 細胞応答の誘導が保護に必要であることが判明した39。 しかし、最近の報告では、ヒト中和モノクローナル抗体KZ52をマカクモデルに受動投与しても感染を抑制できないことが示されており、免疫グロブリンの保護的役割は不明なままである40。 これらのことから、致死的な感染から身を守るためには、早期に強固な、しかし一過性の自然免疫反応とそれに続く適応免疫反応の活性化が必要であることが次第に明らかになってきている。 このような宿主免疫応答が生じない場合、ウイルスは免疫制御を回避し、感染は末期的な疾患へと進行する。

感染の病原性

エボラウイルス感染で死亡する患者に見られる病理学的変化には、凝固異常、血管透過、出血、臓器の壊死や不全などがあります。 現在の仮説では、エボラウイルス感染症の基本的な発症機序は、感染・活性化した単球やマクロファージによる炎症性サイトカインやケモカインの放出、感染後期のウイルス複製による内皮細胞の直接障害による、凝固異常や血管透過性の上昇に続発する血管障害・損傷である41、42と考えられている。 サイトカインストーム」に加えて、ウイルス自体も免疫抑制を引き起こし、宿主細胞に直接ダメージを与えることが明らかになっている4,43,44。 したがって、感染の有害な症状は、一部は機能不全に陥った免疫細胞から分泌される因子に由来し、一部はウイルスによって誘発された宿主の組織や臓器の損傷に由来する。

エボラウイルスは、in vitroで自然免疫系の細胞、内皮細胞、樹状細胞およびいくつかのタイプの上皮細胞に向性であることがわかる。 感染した細胞では異常に高い増殖速度で複製が行われます。 異なる種類の細胞におけるウイルスの複製能力は、in vivoではあまりよく知られていません。 しかし、ザイール種のエボラ出血熱の少なくとも1回の発生では、血清1ミリリットル当たり106プラーク形成単位（PFU/ml）を超えるウイルス量が確認されている45。 感染した非ヒト霊長類のウイルス血症は、最大で107 PFU/mlに達することがあります46。 致死的な感染をしたヒトでは、1mlあたり1010コピーのウイルスRNAが検出されるが、エボラウイルス感染から生還したヒトの血清では、はるかに少ない（107コピー/ml）47。 高いウイルス複製率により、肝臓、脾臓、腎臓、生殖腺など多くの臓器の細胞で溶解と壊死が起こる。 感染組織内への浸潤はほとんどなく、壊死した残骸の中に非常に多くのウイルス粒子が存在することから、観察される壊死の多くはウイルスによるものである。 また、感染したヒトの組織を顕微鏡で観察すると、組織の損傷とウイルス抗原、核酸、ウイルス複製部位の存在との間に相関関係があることがわかる4,43,44。 この観察は、組織や臓器の直接的なウイルス損傷が臓器不全やショックにつながる可能性を示している。

特定の細胞タイプの感染がエボラウイルス病原体において重要な役割を担っている。 自然免疫細胞への感染は、ヒト感染時のウイルスの全身への播種に極めて重要であると考えられている8,10。 感染した単球やマクロファージは、感染部位からリンパ節に移動し、そこでさらに単球やマクロファージが動員され、感染目標となる。 これらの細胞への感染により、ウイルスはさらに増幅され、リンパ系を経由して播種される12。 さらに、肝細胞の感染と壊死は、肝機能の障害を引き起こします。 ほとんどのフィロウイルス感染症で肝酵素は上昇し48,49,50、肝機能の低下は、致死的感染時に顕著な凝固因子の合成低下と凝固障害の発現を説明することができる。 最後に、疾患の後期におけるショックの発症は多因子性であり、出血とともに、副腎皮質の細胞の感染とそれによる壊死が一因である可能性がある50。 血管の完全性の喪失は、ヒトや非ヒト霊長類において疾患の後期にしばしば観察され、出血や組織空間間の体液の不均衡に関連している。 内皮の透過性をもたらす完全なメカニズムは解明されていない。 いくつかの研究により、ウイルスによって誘発された炎症性メディエーターの放出が、in vitroで血管透過性を高めることが示されている11,51。 しかし、内皮細胞は疾患の後期において感染の標的であり、内皮細胞に対するウイルスによる直接的な細胞傷害性が、出血性症状の増加の一因であることは否定できない。 実際、ウイルスエンベロープ糖タンパク質GPは、血管細胞傷害の主要な決定要因の一つとして関与している。

GPは、ウイルス侵入における重要性とワクチン開発の標的としての可能性から、最も研究されているエボラウイルスタンパク質の一つである。 また、前述のように、病原体としての役割の可能性もあるため、精力的に研究されている。 この糖タンパク質は、病原性に関連する細胞にウイルスをターゲッティングする役割を担っている。 GPは、リンパ球の接着と抗原提示に必須な細胞表面タンパク質のダウンレギュレーションに作用することにより、免疫抑制に関与していると考えられる52,53。 可溶性GPは、ウイルスや感染細胞を標的とする中和抗体と競合する可能性が指摘されていますが54,55、そのような抗体の保護的役割は証明されておらず、可溶性GPの生化学および抗体反応性は、膜結合型3量体スパイクのそれとは異なります56,57。 可溶性GPは好中球の活性化57を抑制することから、ウイルス免疫が自然炎症反応に影響を与える可能性があることが示唆された。 エボラウイルスの侵入は、抗原提示に重要な酵素であるエンドソームのカテプシンにも依存し58,59、カテプシンの放出は、ウイルスによる細胞障害に寄与しているかもしれない60

いくつかのグループが、GPに直接細胞毒性があることを明らかにしている。 Yangらは、7つのウイルス遺伝子産物のうち、GPがin vitroとex vivoの両方で内皮細胞における細胞の丸みと剥離の原因となり、これが血管透過性を大幅に増加させることを見いだした61。 エボラウイルスの4種すべてのGPの発現は、in vitroの細胞株や初代細胞において、細胞の丸みと剥離、それに続く細胞死を特徴とする様々な程度の細胞毒性を誘発する61。 これらの効果は、糖タンパク質の重グリコシル化されたムチン様ドメインによって媒介される。 ウイルスの生感染時におけるGPの細胞傷害性の役割については議論があるが62、GPによる細胞傷害性の違いは、異なるウイルス種の死亡率と相関しており52,61、この遺伝子産物が病態に重要であることが示唆される。 膜結合型GPの発現は、ウイルスポリメラーゼによる転写編集を伴う機構によって、ウイルス複製時に正確に制御されているようである63。 このことは、この糖タンパク質が感染時の病原性を決定する重要なウイルス因子である可能性を示している。

このように、ウイルス誘導因子と宿主因子が結合して、エボラウイルス感染に対する致命的な反応が、BおよびT細胞媒介免疫両方の抑制と常に相関する破壊的経路をもたらすのである。 回復しない患者は、実質的にウイルス抗原特異的な抗体を持っていない。 致死的感染者の30％にのみ低量の特異的免疫グロブリンMsが存在し、特異的免疫グロブリンGsは検出されない30,64,65。 細胞傷害性T細胞やCD4+ヘルパーT細胞応答の開始は限られているようであるが、これは致死例ではこれらの細胞が枯渇しているためと思われる。 リンパ球の枯渇は、マクロファージや他の炎症細胞内での制御不能なウイルス複製を悪化させる可能性が高い。 したがって、致命的なエボラウイルス感染症は、異常な非特異的かつ有害な自然免疫反応の発現と、抗原特異的な適応反応のほとんどあるいは全くない刺激に代表される広範な免疫抑制が特徴である。 この反応の欠如により、圧倒的なウイルス負荷が生じ、結果として免疫およびウイルスが介在する病理学がもたらされる＜8728＞ ＜4939＞ 他の致死性の高い病原体との関連性および今後の研究＜8728＞ ＜4939＞ エボラウイルスのような強毒性の病原体に対する免疫反応を調べることにより、宿主免疫系の重要な特徴について価値ある洞察を得ることができる。 1つの傾向として、致死性の急性病原体は適応免疫反応が起こる前に急速に死滅する傾向があるが、慢性病原体は適応免疫反応にもかかわらず生存し複製することができる、ということが明らかになりつつある。 この点で、エボラウイルス感染と高病原性1918年インフルエンザウイルスとの間には、興味深い類似点がある（Ahmedらによる付随の総説を参照66）。 例えば、Kobasaらは、再構成した1918年型インフルエンザウイルスが高レベルのウイルス複製を示し、それが感染したカニクイザルの肺組織における巨視的な病変と相関していることを発見した67。 この動物モデルの感染は、急性呼吸困難となり、圧倒的に致死的な結果となった。 興味深いことに、感染した動物は、多くの点で非ヒト霊長類におけるエボラ感染時に観察された反応と類似した免疫反応を起こすことができた。 1918年型インフルエンザに対する免疫反応は、異常なインターフェロン反応と、異常に高いレベルのサイトカインおよびケモカインの発現によって特徴づけられた。 著者らは、1918年インフルエンザ株の高い致死性は、防御には不十分な非定型で有害な自然免疫反応の発生に一部起因すると結論付けた。

エボラと1918年インフルエンザウイルスに対する免疫反応の比較は、これらのウイルスの高い致死性は、高いウイルス力価および直接的ウイルス損傷による有害作用と非特異的かつ異常に持続する自然免疫反応の組み合わせから生じるかもしれないと述べている。 圧倒的なウイルス血症、自然免疫反応の制御不能、適応免疫の発達不全という同様の状況は、重症急性呼吸器症候群（SARS）コロナウイルス、マールブルグウイルス、ラッサ熱ウイルスなど、他の高致死性ウイルスでも観察されている。 いずれの場合も、ウイルスはその圧倒的な複製によって致死的な感染を引き起こすと思われるが、特異的受容体、細胞や器官のトロピズム、炎症や免疫を回避するメカニズム、自然貯蔵庫は異なるかもしれない。

ウイルスによる免疫調節異常のメカニズムや程度については多くの問題が未解決のままである。 例えば、リンパ球のアポトーシスの機構は不明である。 エボラウイルスはこれらの細胞を直接標的にしないが、宿主でウイルス力価が測定可能になると、その数は急速に枯渇する。 これらの細胞は局所的なサイトカインの不均衡によりアレルギー性終末分化に入るのか、あるいは他の免疫細胞による異常な標的破壊があるのか？ また、エボラウイルスが特定のDCに対してトロピズムを示し、抗ウイルス反応の回避を促進するかどうかも不明である。 DCの抗原提示がどのようなメカニズムで障害されるかは不明である。 カテプシンも抗原処理に関与しているので、適応免疫反応に影響を与える可能性もある。 生体内でのウイルス複製の詳細についても、同様の疑問が残されている。 エボラウイルスはマクロファージ、DC、内皮細胞など様々な種類の細胞の免疫染色で検出されるが、ウイルスはこれらの細胞の多くに存在するレクチン受容体に結合する。したがって、ある細胞にウイルスが存在することが、活発な複製を意味するのか、単に細胞表面への結合にすぎないのかは、不明である。 最後に、内皮細胞に対する直接的なウイルスの細胞毒性に対するサイトカインストームの役割は、多くの推測の対象であるが、残念ながらデータはほとんどない。

最終的には、防御における免疫系の特定の部分の役割を含むこれらの問題の多くは、ヒト以外の感染モデルにおいてサイトカイン、サイトカイン受容体およびリンパ球サブセットに対して生体内で抗体デプレションを用いた研究によって解決できるかもしれない。 これらの重要な問題が解決されるまでは、現在の仮説はエボラウイルスによる病態生理を広い意味で説明している。すなわち、制御不能な非特異的炎症反応、ウイルスに誘導された免疫抑制、いくつかのタイプの細胞の直接的なウイルス破壊などの要因が複合的に作用して、血管系の崩壊、多臓器不全、ショック様症候群という致死的エボラウイルス感染症を引き起こすというものだ

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