Resultados y discusión
Estabilidad del genoma del VARV y análisis filogenético.
Para el estudio evolutivo del VARV se aprovechó la disponibilidad de las secuencias del genoma de una colección de aislados del VARV con una amplia distribución geográfica (Fig. 1) (4). El VARV, miembro del género Orthopoxvirus, contiene un único genoma lineal de ADN de doble cadena de 186 kb que codifica la mayoría de las enzimas para su propagación (5). Los aislados de VARV estudiados demostraron una baja tasa de mutación porque los aislados vinculados epidemiológicamente mostraron pocos o ningún cambio de secuencia en muestras con tiempos de recogida de hasta 1 año de diferencia. Esta baja tasa de mutación puede verse claramente en nuestras muestras genéticamente idénticas de Bangladesh recogidas entre 1974 y 1975. Estas muestras representan ciertamente largas y complejas cadenas de transmisión de una de las regiones más densamente pobladas del mundo, pero tienen secuencias de nucleótidos idénticas o casi idénticas. El Orthopoxvirus del virus de la viruela del mono, relacionado con el anterior, muestra igualmente cambios de nucleótidos únicos o nulos entre los aislados de tres huéspedes diferentes en un reciente brote en Estados Unidos (6). Dentro de las especies de ortopoxvirus y entre ellas, los genomas poseen identidades nucleotídicas de >99,6% entre los aislados del VARV y del 98% entre el VARV y taxones congéneres como el virus del taterapox (TATV) (4) (África occidental) y el virus del camello (CMLV) (7) (Asia central) (Tabla 1), dos especies con la mayor similitud de secuencia con el VARV (4). El gran tamaño y la lenta tasa de sustitución de nucleótidos permiten que el ADN genómico del VARV retenga mutaciones filogenéticamente informativas, al tiempo que disminuye la incidencia de mutaciones homoplásticas (es decir, menos inversiones de estado de los caracteres). La diversidad de 47 genomas de VARV recientemente secuenciados se asoció en gran medida con el origen geográfico de los aislados (ref. 4 y este estudio), y las mutaciones tuvieron una asociación mínima con la variación temporal entre los aislados. Estas observaciones demuestran que no hubo una única cepa pandémica ( SI Text , Nota 1), sino que los clados genéticos de estos análisis son representativos de cepas endémicas locales antiguas y quizás antiguas.
Hipótesis del origen del VARV. Evento 0, La alta similitud del VARV con las secuencias genómicas del CMLV y del TATV sugiere que el TATV y el CMLV comparten un ancestro común más reciente con el VARV que otras especies conocidas de Orthopoxvirus. Evento 1, hipótesis A: Un VARV ancestral divergió en dos clados primarios (P-I y P-II) y evolucionó independientemente en el Viejo y el Nuevo Mundo siguiendo a sus huéspedes humanos. Evento 1, hipótesis B: La divergencia de P-I/P-II en África. Evento 2, hipótesis A y B: La larga rama única y la posterior radiación de P-I sugieren que el VARV ancestral de P-I probablemente se originó en el noreste de Asia y que la viruela endémica de P-I comenzó a extenderse a Asia oriental, Oriente Medio y la India cuando las poblaciones locales se hicieron lo suficientemente grandes. Evento 2a, La diversificación y migración de la P-I por toda Asia. Evento 2b, La exploración occidental llevó el VARV mayor a Sudáfrica desde el subcontinente indio, que luego se extendió hacia el norte hasta África Central y el Cuerno de África (Península Somalí). Eventos 3 y 4, hipótesis A: La diversificación de P-II en el Nuevo Mundo seguida de su reintroducción en África; hipótesis B: La diversificación de P-II en África, seguida de la posterior introducción de un subclado en el Nuevo Mundo.
Si la radiación P-I representa la historia endémica de la viruela en el Viejo Mundo, explica el enigma histórico relativo a la ausencia de una descripción de la viruela en la literatura de las antiguas civilizaciones griega y romana (1). Es probable que las epidemias de viruela en esta región se produjeran en una época posterior a las de la antigua China e India. La «peste de Atenas» del año 430 a.C. descrita por Tucídides, que en su día se consideró viruela (3), contradiría esta teoría, pero recientemente se ha determinado que era fiebre tifoidea (25). Durante el reinado de Ramsés V, Egipto estaba en guerra civil y era atacado por enemigos del norte (3); si la erupción pustulosa de Ramsés V era de viruela, podría representar un brote de viruela de casos importados a causa de la guerra y no una enfermedad endémica regional. Esta hipótesis se ve apoyada por el hecho de que sólo tres momias de ese período presentaban lesiones similares (2).
Diversificación de la alastrim minor.
Los análisis basados en la topología de la historia de la viruela/VARV muestran que la divergencia de la alastrim minor y la variola de África occidental comenzó hace al menos 800 años (Tabla 2 y Tabla SI 4), lo que antecede a la hipótesis anterior de que esta divergencia coincide con el inicio del comercio de esclavos. Bajo la hipótesis de un origen más antiguo, esta divergencia podría haber ocurrido después de un evento de especiación en el Nuevo Mundo (basado en la calibración de los primeros registros históricos de la viruela; Fig. 3 A) o en África Occidental (basado en la calibración de los registros históricos de la viruela sudafricana; Fig. 3 B). Estos escenarios sugerirían que había aislados de variola minor/alastrim no identificados que existían en África o en el Nuevo Mundo mucho antes del descubrimiento de alastrim minor (P-II); por lo tanto, este taxón tiene una historia más larga de lo que se ha descrito.
Aunque la importación bien documentada del VARV major a las Américas tuvo un efecto devastador en muchas de las poblaciones nativas (2), los registros de la rápida propagación de la enfermedad con gran mortalidad podrían atribuirse, en parte, al efecto combinado de la alta densidad de población, la falta de cuidados básicos para las víctimas y las posibles coinfecciones con otras enfermedades del Viejo Mundo (26, 27). Históricamente, hay pocos registros de viruela en África Occidental, y Henige (28) argumentó que el primer brote importante de viruela en el Nuevo Mundo no se originó en África Occidental, lo que refutaría la hipótesis de una historia temprana de viruela en África Occidental. Es posible que después de una antigua introducción, el alastrim evolucionara de forma independiente en regiones aisladas dentro de la gran área geográfica del Nuevo Mundo. De hecho, el estudio de Phelan demostró que las poblaciones nativas de la Sierra de Ecuador no disminuyeron durante el dominio español inicial (al que se le atribuye haber introducido el VARV mayor en el Nuevo Mundo) (29), lo que sugiere que estas poblaciones podrían haber sido más resistentes a la viruela, tal vez por un contacto previo con el alastrim. En Trinidad, se documentó que un leve brote de viruela en 1902 se originó en esta región (30). Si esta diversificación ocurrió en el Nuevo Mundo, entonces el evento de aislamiento primario probablemente habría resultado del movimiento de un VARV ancestral con los primeros humanos hacia esa región (Fig. 4A). La ausencia de firmas SNP que sugieren la mezcla entre P-I y P-II (SI Figs. 6 y 7), las características clínicas consistentes y significativamente diferentes de alastrim del VARV mayor tradicional de P-I (31), podrían explicarse por una separación geográfica tan significativa.
Si la división de P-I/P-II ocurrió dentro del Viejo Mundo, P-II probablemente se originó en África Occidental. Los dos subclados P-II habrían divergido entonces ≈800-1,100 YBP (Tabla 2 y Tabla SI 4) en el continente africano. Las distribuciones geográficas de estos eventos son difíciles de determinar debido a la falta de historia escrita en estas regiones. Sin embargo, la presencia y diversificación de otros Orthopoxviruses estrechamente relacionados, como el de la viruela del mono y el TATV, podría apoyar un origen africano para los VARV ancestrales. Si el aislamiento y la diversificación de P-II ocurrieron en África, entonces, basándonos en nuestra filogenia, hay un representante africano no descrito del subclado P-II, que fue introducido en el Nuevo Mundo quizás cientos de años después del evento de diversificación, posiblemente durante la época del comercio de esclavos entre los países del Viejo y el Nuevo Mundo (Fig. 3 B).
Un conocimiento inadecuado de la historia de estas culturas y los síntomas clínicos relativamente más leves (con respecto a la variola major) contribuyen a la ausencia de un registro histórico más extenso de la(s) enfermedad(es) de la viruela en el Nuevo Mundo o en el África subsahariana. Las densidades históricas de la población humana en estas dos regiones eran más bajas que las regiones con variola major endémica. En los casos de enfermedad más leve, los individuos habrían sido más móviles cuando eran infecciosos y habrían tenido un mayor número de contactos, perpetuando así la propagación de la enfermedad. En apoyo de esta hipótesis, los brotes leves de viruela en Somalia persistieron durante largos periodos entre pequeñas bandas nómadas y mostraron un patrón de transmisión significativamente diferente al del VARV major (2). Aunque se desconoce si la práctica de la variolación/inoculación fue utilizada por los pueblos indígenas de África o América, la longevidad del VARV dentro de las costras convalecientes (hasta una década) (32-34) proporcionaría otro mecanismo para la introducción repetida de una cepa de viruela dentro de una comunidad geográfica, ya sea por contacto inadvertido con materiales de las costras o directamente a través de las prácticas de variolación.
Origen del VARV.
Posibles pistas sobre la adaptación del VARV a los humanos pueden encontrarse en la estrecha relación entre el VARV y el TATV/CMLV (4). El TATV está asociado a un roedor terrestre nativo de África Occidental (35). Nuestros análisis de coalescencia indican que la divergencia entre el VARV y el TATV se produjo entre los 16.000 años AP (Tabla 2 y SI Dataset 4, basados en los registros históricos de la viruela de Sudáfrica) y los 68.000 años AP (Tabla 2 y SI Dataset 3, basados en los primeros registros históricos de la viruela en Asia Oriental). Así, al igual que los ortopoxvirus zoonóticos relacionados con reservorios de roedores (6, 36, 37), el VARV puede haber evolucionado a partir de un patógeno enzoótico de roedores africanos y, posteriormente, haberse extendido fuera de África.
Las secuencias genómicas de los aislados del VARV seleccionados para este estudio se tomaron del repositorio del Centro Colaborador de la Organización Mundial de la Salud y, aunque muestran un bajo nivel de divergencia de secuencias, son representativas de la mayor diversidad geográfica y temporal dentro de la colección. La filogenia derivada de cSNP de estos aislados produce una topología consistente con los patrones migratorios humanos históricos, la expansión de la población y las epidemias de viruela documentadas. La topología representada apoya la hipótesis (Fig. 3) de que dos clados de variola divergieron de un virus ancestral y posteriormente evolucionaron en poblaciones humanas geográficamente discretas. Aunque la razón de la diferente patogénesis humana de alastrim y VARV major no está clara, la estructura genética de alastrim minor y su topología con los otros aislados de VARV añaden piezas críticas al rompecabezas evolutivo de la viruela. Esta propuesta de filogenia del VARV amplía el tiempo de evolución de la viruela en relación con el de las teorías anteriores.