Efectos de la dosis y el tiempo de la ingesta de cafeína en los receptores de adenosina A2A de las plaquetas humanas

La cafeína, que se encuentra en diferentes fuentes como el café, el té, el chocolate y las bebidas de cola, es la sustancia más activa del mundo. El consumo medio de cafeína por parte de los seres humanos adultos varía entre las distintas culturas y naciones de 80 a 400 mg por persona y día.1 La cafeína provoca un número diverso de respuestas farmacológicas, entre las que se incluyen el aumento de la vigilancia, la disminución del tiempo de reacción psicomotriz y el aumento de la latencia del sueño y del tiempo de vigilia, y también puede influir en el rendimiento intelectual.2 Además, la cafeína provoca la relajación de los músculos lisos, aumenta la secreción de ácido gástrico y la liberación de catecolaminas, e incrementa la actividad metabólica.3

El mecanismo o mecanismos precisos que subyacen a las acciones de la cafeína siguen sin estar bien definidos. Aunque la inhibición de las fosfodiesterasas puede contribuir a las acciones de la cafeína,4 cada vez hay más pruebas de que la mayoría de los efectos farmacológicos de esta xantina son el resultado del antagonismo de los receptores de adenosina designados como subtipos A1, A2A, A2B y A3.5 La cafeína actúa con mayor potencia en los receptores A2A, seguidos de cerca por los receptores A1, luego por los receptores A2B,6 y como antagonista débil en los receptores A3 humanos. El bloqueo por cafeína de los receptores de adenosina, en concreto de los tipos de receptores A1 y A2A, inhibe la acción de la adenosina endógena en diversos procesos fisiológicos.7 En condiciones normales, los niveles de adenosina en sangre parecen ser suficientes para activar tónicamente los receptores A2A en las plaquetas. Recientemente, en ratones sin receptores A2A, se informó de que la agregación plaquetaria estaba aumentada, lo que indica la importancia de este subtipo de receptor en la función plaquetaria.8 Por lo tanto, es concebible que la cafeína pueda bloquear estos receptores A2A activados tónicamente en las plaquetas y alterar sus funciones moduladas por la adenosina.

Durante muchos años se ha sospechado de una asociación entre el consumo de café y las enfermedades cardiovasculares, en particular la cardiopatía coronaria,9 pero recientemente se ha demostrado que el consumo de café o cafeína no aumenta el riesgo de cardiopatías coronarias o accidentes cerebrovasculares.1011 Numerosos estudios epidemiológicos que tienen en cuenta el infarto de miocardio no han encontrado ningún efecto perjudicial con <5 tazas de café al día, mientras que los resultados son controvertidos con niveles de ingesta más elevados.12 En pacientes con hipertensión, no se observó ningún riesgo de resultados adversos con ningún nivel de ingesta de cafeína.13

Un estudio de Biaggioni et al14 descubrió que un régimen de dosis repetidas de cafeína produce cambios significativos en las plaquetas humanas en las respuestas funcionales al agonista del receptor de adenosina 5′-N-etilcarboxamidoadenosina (NECA). La retirada de la cafeína produjo un desplazamiento significativo hacia la izquierda de la inhibición de la agregación inducida por la NECA.14 En consonancia con lo anterior, recientemente demostramos,15 en sujetos tratados con 750 mg/d durante 1 semana, que la ingesta crónica de cafeína altera la agregabilidad plaquetaria como resultado de la regulación al alza de los receptores A2A localizados en la superficie de las plaquetas.

En el presente artículo, aportamos más pruebas de que se encuentra una respuesta similar en sujetos tratados con cafeína a diferentes dosis, como 600 mg/d durante 1 semana o 400 mg/d, administrada durante un periodo de tiempo más largo, como 2 semanas. En el presente estudio, esto se hizo midiendo directamente los cambios en los receptores A2A de adenosina (densidad y afinidad) y su función, determinando el efecto del agonista selectivo A2A 2-hexinil-NECA (HE-NECA) para (1) aumentar la acumulación de AMPc, (2) inhibir la agregación plaquetaria y (3) disminuir los niveles de calcio intracelular. Tras el consumo crónico (600 mg/día durante 1 semana o 400 mg/día durante 2 semanas), se observó una regulación al alza de los receptores A2A de adenosina de las plaquetas, que estaba altamente correlacionada con los efectos antiagregantes, un aumento de la acumulación de AMPc y una disminución de los niveles de calcio intracelular. No se revelaron diferencias en los parámetros de unión y funcionales de los sujetos tratados con 400 mg/día durante 1 semana.

Métodos

Se estudiaron 45 sujetos sanos, no fumadores, de 25 a 45 años de edad, de ambos sexos. Tras haber dado su consentimiento informado por escrito, se pidió a los sujetos que se abstuvieran de tomar metilxantinas en la dieta durante ≥2 semanas. Se dividieron en 3 grupos (15 sujetos cada uno) según el régimen de administración de cafeína (es decir, dosis y duración de la administración): 200 mg por vía oral 2 veces al día durante un período de 7 días (grupo 1); 200 mg por vía oral 2 veces al día durante un período de 14 días (grupo 2); y 200 mg por vía oral 3 veces al día durante un período de 7 días (grupo 3). Se estudiaron las plaquetas de estos sujetos antes de empezar a tomar cafeína (día 0) y a las 1, 12, 60 y 108 horas después de la última dosis de cafeína. En particular, el punto temporal de 1 hora se estudió sólo en el grupo que recibió la dosis máxima de cafeína (600 mg/día). La EC50 y la IC50 en los ensayos funcionales no pudieron obtenerse a 1 hora debido a los problemas prácticos relacionados con la extracción excesiva de sangre en un periodo de tiempo estrecho (de 1 a 12 horas).

Ensayo de unión de SCH 58261 en membranas de plaquetas humanas

Las membranas de plaquetas humanas se prepararon como se describió previamente16 y se utilizaron para los ensayos de unión de radioligandos con SCH 58261 según Varani et al.17 En los estudios de saturación, las membranas de plaquetas humanas se incubaron con 8 a 10 concentraciones diferentes de SCH 58261 que iban de 0,01 a 10 nmol/L. La unión no específica se determinó en presencia de NECA 10 μmol/L. Después de 60 minutos de incubación a 4°C, las muestras se filtraron a través de filtros Whatman GF/B con un Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Para el análisis informático de los datos de los experimentos de saturación se utilizó un programa de ajuste de curvas no lineales por mínimos cuadrados, LIGAND,18.

Medición de los niveles de AMPc en plaquetas humanas

Las plaquetas humanas lavadas obtenidas de la sangre periférica de voluntarios sanos se prepararon como se ha descrito anteriormente.16 Las plaquetas (6×104 a 8×104 células) se incubaron con 1,0 U de adenosina deaminasa/mL, 0,5 mmol/L de 4-(3-butoxi-4-metoxibencil)-2-imidazolidinona (Ro 20-1724) como inhibidor de la fosfodiesterasa, y 6 a 8 concentraciones diferentes de HE-NECA. Los valores EC50 se obtuvieron a partir de las curvas de concentración-respuesta tras la transformación log-logit de las variables dependientes mediante un método de mínimos cuadrados ponderados.19 La solución acuosa final se analizó para determinar los niveles de AMPc mediante un ensayo de unión a proteínas de competición.15

Ensayo de agregación plaquetaria

Se centrifugó sangre humana citada a 200g durante 10 minutos para obtener plasma rico en plaquetas y a 2500g durante 20 minutos para obtener plasma pobre en plaquetas. El recuento de plaquetas humanas se realizó en un contador Coulter modelo S8/80 (Coulter Electronics Inc) y se ajustó a 2,5×108/mL a 3,5×108/mL con plasma autólogo pobre en plaquetas. La agregación plaquetaria se realizó según la técnica turbidimétrica de Born20 con un Aggrecorder DIC PA-3220 (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Después de la incubación durante 3 minutos con 6 a 8 concentraciones diferentes de HE-NECA, el plasma rico en plaquetas fue agregado a 37°C bajo agitación continua con ADP. Se realizaron experimentos similares con ADP a diferentes concentraciones (100 nmol/L a 100 μmol/L). La agregación máxima, registrada 5 minutos después de la adición de ADP, se utilizó para el análisis cuantitativo, y el porcentaje de inhibición se calculó en relación con los valores de control.21

Mediciones de la concentración de Ca2+ libre citoplasmático

La concentración de calcio libre citosólico se midió mediante el uso de la técnica de fura 2 según Paul et al.22 Brevemente, las plaquetas se incubaron en oscuridad total durante 30 minutos a 37°C con 1 μmol/L de fura 2-AM y se agitaron magnéticamente en cubetas de fluorímetro (LS50, Perkin Elmer, Ltd) a una concentración de 108/mL en presencia de 250 μmol/L de sulfinpirazona. La concentración intracelular de Ca2+ (i) se determinó con una relación de excitación de 340/380 y una longitud de onda de emisión de 505 nm.

Análisis estadístico

El análisis de los datos se realizó mediante ANOVA de 1 vía. El análisis de las diferencias entre los grupos tratados con cafeína (12, 60 y 108 horas) y los sujetos de control se realizó con la prueba t de Student (análisis no apareado). Las diferencias se consideraron significativas a un valor de P<0,01. Todos los datos se presentan como media±SEM.

Resultados

Las plaquetas de los 3 grupos de sujetos se cosecharon antes de comenzar la administración de cafeína (día 0, control) y a las 1, 12, 60 y 108 horas después de la última dosis (retirada de la cafeína). La tabla resume los resultados de los experimentos de unión y funcionales de los 3 grupos de sujetos.

Grupo 1 (400 mg/día durante 1 semana)

Los parámetros de unión revelaron un valor Bmax de control de 105±6 fmol/mg de proteína y un valor KD de 1,28±0,08 nmol/L. En las plaquetas de control, la HE-NECA aumentó los niveles de AMPc con una EC50 de 60±5 nmol/L e inhibió (1) la agregación con una IC50 de 86±10 nmol/L y (2) los niveles de calcio con una IC50 de 104±8 nmol/L. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas en los parámetros de unión y funcionales a las 12, 60 y 108 horas después de la retirada de la cafeína (Tabla).

El grupo 2 (400 mg/durante 2 semanas)

Los parámetros de unión revelaron un valor Bmax de control de 110±3 fmol/mg de proteína y un valor KD de 1,21±0,09 nmol/L. A las 12 y 60 horas después de la retirada de la cafeína, las densidades del receptor, Bmax, aumentaron en ambos puntos temporales en un 20% aproximadamente, pero los valores de KD no cambiaron. Los experimentos funcionales revelaron que el agonista del receptor A2A de adenosina HE-NECA fue significativamente más potente en el aumento del AMPc de las plaquetas (es decir, los valores de EC50 fueron un 45% y un 65% menores a las 12 y 60 horas después de la retirada de la cafeína que los valores de control, respectivamente). Se observó una tendencia similar en los valores de IC50 obtenidos en los experimentos de agregación y en las mediciones de la concentración de calcio libre citoplásmico (Tabla).

Grupo 3 (600 mg/día durante 1 semana)

En general, obtuvimos datos similares a los del grupo 2. SCH 58261 se unió a una única clase de sitios de afinidad en las membranas de las plaquetas de los controles con una Bmax de 100±4 fmol/mg de proteína y una KD de 1,27±0,09 nmol/L. Como se muestra en la Figura 1A, en las membranas de las plaquetas recogidas a las 1, 12, 60 y 108 horas después de la retirada de la cafeína, el radioligando se unió con la misma afinidad, pero el número de sitios de unión (Bmax) aumentó significativamente (P<0,01). En estudios paralelos, se determinaron las respuestas funcionales de las plaquetas al agonista del receptor A2A HE-NECA. Como se resume en la tabla, la potencia del HE-NECA para (1) aumentar la formación de AMPc, (2) inhibir la agregación plaquetaria inducida por ADP y (3) disminuir los niveles de calcio se incrementó significativamente en las plaquetas obtenidas a las 12, 60 y 108 horas después de la retirada de la cafeína (Figura 1B, 1C y 1D). También se llevaron a cabo experimentos para determinar si el aumento de la densidad de los receptores A2A iría acompañado de una disminución de la potencia y/o eficacia del ADP para inducir la agregación. Los valores de EC50 del ADP para estimular la agregación plaquetaria a las 12, 60 y 108 horas después de la retirada de la cafeína fueron de 0,7±0,2, 0,9±0,1 y 0,8±0,1 μmol/L, respectivamente, valores no significativamente diferentes de los 0,9±0.2 μmol/L obtenidos en las plaquetas de los controles (Figura 2).

Discusión

Los efectos de la administración a largo plazo de cafeína en humanos y animales y su papel en su tolerancia a las acciones de la cafeína son controvertidos. Algunos estudios que mostraban un aumento de los receptores A1 en el cerebro de los ratones encontraron pruebas de una regulación al alza de los receptores A1 por parte de la cafeína.23 Otros estudios revelaron una regulación al alza de los receptores A2A, lo que sugiere un efecto adaptativo de la ingesta de cafeína.24 Además, el consumo crónico de cafeína puede conducir a una reducción de la agregabilidad de las plaquetas como resultado de la regulación al alza de los receptores A2A localizados en la superficie de las plaquetas14 que desempeñan un papel potencial en los procesos fisiopatológicos, como la agregación y la trombogénesis. Aunque estos cambios pueden contribuir a las alteraciones de la función plaquetaria, la tolerancia a la cafeína no modifica la potencia de esta xantina como antagonista competitivo de los efectos de la adenosina.25 Otros cambios, como el desplazamiento de la afinidad de los receptores a un estado de alta afinidad, las alteraciones de los niveles de las proteínas G o el acoplamiento de estas proteínas a los receptores de adenosina, o la ocupación a largo plazo de los receptores pueden estar implicados en el fenómeno de la tolerancia.26 Los síntomas de abstinencia a la cafeína se producen en los seres humanos; suelen ser dolor de cabeza, fatiga, apatía y somnolencia.9 En particular, la cafeína aumenta la concentración de adenosina en el plasma, y su reducción tras la retirada del antagonista sugiere una regulación de la concentración de adenosina en el plasma mediada por el receptor.27 Durante la isquemia y/o la hipoxia, la adenosina también tiene acciones neuroprotectoras. En el cerebro adulto, el tratamiento crónico con cafeína, que conduce a la regulación al alza de los receptores de adenosina, reduce el daño isquémico, mientras que la exposición aguda (efecto antagonista del receptor) aumenta el daño isquémico.28

Se ha demostrado que la ingesta crónica de cafeína altera la respuesta de las plaquetas a las acciones de la adenosina.14 La administración repetida de cafeína (750 mg/durante 1 semana) reveló un aumento de la densidad del receptor A2A, acompañado de una sensibilización de las respuestas plaquetarias, como un aumento de la acumulación de AMPc y una disminución de la agregación plaquetaria.15 El objetivo del presente estudio fue determinar el efecto de la dosis de cafeína y de la duración de la administración sobre los parámetros de unión y funcionales. Por lo tanto, estudiamos los cambios en la densidad y afinidad de los receptores A2A de adenosina en las membranas de las plaquetas humanas de sujetos tratados con diferentes dosis (400 o 600 mg/día) durante diferentes períodos de ingesta de cafeína (1 o 2 semanas). En concreto, se estudiaron sujetos de control (antes de la administración de cafeína) y tratados con cafeína (1, 12, 60 y 108 horas después de la última dosis de cafeína).

El tratamiento con 400 mg/día de cafeína durante 1 semana no modificó los parámetros funcionales y de unión del receptor A2A. Sin embargo, el tratamiento con 400 mg/d durante 2 semanas o 600 mg/d durante 1 semana produjo (1) un aumento significativo (upregulation) de los sitios de unión de la adenosina A2A, (2) un aumento de la acumulación de AMPc, (3) un aumento de los efectos antiagregantes, y (4) una disminución de los niveles de calcio provocados por el agonista del receptor A2A HE-NECA.

La upregulation de los receptores A2A puede atribuirse probablemente a la síntesis de nuevos receptores durante la diferenciación de las células precursoras. Esta interpretación se basa en los resultados de los experimentos in vitro que muestran que la incubación del plasma rico en plaquetas de sujetos de control durante un periodo de 6 o 12 horas con cafeína o SCH 58261 no afectó a los parámetros de unión.15 La regulación al alza de los receptores A2A de adenosina causada por la ingesta crónica de cafeína podría interpretarse como un indicio de que la adenosina endógena ejerce una influencia tónica sobre las plaquetas humanas, y la presencia del antagonista se ve contrarrestada por la regulación al alza de los receptores A2A. En los adultos, la cafeína se adsorbe eficazmente desde el tracto gastrointestinal; las concentraciones plasmáticas máximas se producen entre 15 y 120 minutos después de la ingestión, y la vida media de la cafeína es de 2,5 a 4,5 horas.7 El aumento de los receptores A2A de adenosina hallado una hora después de la última dosis de tratamiento con cafeína fue similar al obtenido a las 12 o 60 horas después de la retirada de la cafeína, lo que demuestra que la retirada no era necesaria para la regulación al alza de los receptores A2A.

Otro objetivo del presente estudio era determinar si los cambios en los parámetros de unión se correlacionaban con los cambios en la respuesta o respuestas funcionales. Se encontró que la agregación plaquetaria se asoció con la activación de la adenilato ciclasa y con un aumento de las concentraciones de calcio intracelular. La potencia de la HE-NECA a las 12, 60 y 108 horas después de la retirada de la cafeína aumentó significativamente en comparación con el grupo de control. Este hallazgo indica que la administración repetida de diferentes dosis de cafeína conduce a cambios significativos en el número de receptores A2A en la superficie de las plaquetas, acompañados de una mayor capacidad de respuesta a la estimulación del receptor. El receptor A2A clásico de la adenosina es responsable de las propiedades antiagregantes de la adenosina y sus análogos, lo que concuerda con la observación de que la agregación es más eficiente en los ratones que carecen de los receptores A2A.8 Sin embargo, la agregación plaquetaria inducida por concentraciones crecientes de ADP no fue significativamente diferente entre los sujetos de control y los tratados con cafeína. Una posible explicación de esta última observación es que no hay suficiente adenosina en el medio de ensayo para producir una respuesta. Alternativamente, en los sujetos tratados con cafeína, la magnitud de la regulación de los receptores (es decir, el número de receptores) no fue suficiente para producir un desplazamiento de la curva concentración-respuesta inducida por el ADP. Sin embargo, cuando los niveles de adenosina endógena aumentan, como ocurre durante la isquemia miocárdica, la concentración extracelular de adenosina se eleva rápidamente hasta un nivel suficiente para actuar sobre los receptores regulados y puede tener mayores efectos inhibidores de las plaquetas que el control. Por lo tanto, es posible que el consumo crónico de cafeína en dosis no muy alejadas de la ingesta dietética media pueda conducir a una reducción paradójica de la agregabilidad plaquetaria durante la isquemia.

En conclusión, todos los datos en conjunto aportan más pruebas de que la ingesta crónica de cafeína altera la respuesta de las plaquetas a las acciones de la adenosina. El principal hallazgo del presente estudio es que los efectos del consumo crónico de cafeína sobre las funciones plaquetarias dependen tanto de la dosis como de la duración del tratamiento y subyacen a una reducción de la agregabilidad plaquetaria debido a la regulación al alza de los receptores A2A de la adenosina.