La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es una forma de cromatografía en columna que bombea una mezcla de muestras o analitos en un disolvente (conocido como fase móvil) a alta presión a través de una columna con material de relleno cromatográfico (fase estacionaria). La muestra es transportada por una corriente de gas portador de helio o nitrógeno en movimiento. La HPLC tiene la capacidad de separar e identificar compuestos presentes en cualquier muestra que pueda estar disuelta en un líquido en concentraciones de trazas tan bajas como partes por trillón. Debido a esta versatilidad, la HPLC se utiliza en una gran variedad de aplicaciones industriales y científicas, como las farmacéuticas, medioambientales, forenses y químicas.
El tiempo de retención de la muestra varía en función de la interacción entre la fase estacionaria, las moléculas que se analizan y el disolvente o los disolventes utilizados. A medida que la muestra pasa por la columna, interactúa entre las dos fases a diferente velocidad, principalmente debido a las diferentes polaridades de los analitos. Los analitos que tienen la menor cantidad de interacción con la fase estacionaria o la mayor cantidad de interacción con la fase móvil saldrán de la columna más rápidamente.
Instrumentación:
Los componentes principales de un sistema de HPLC incluyen el depósito de disolvente, o varios depósitos, una bomba de alta presión, una columna, un sistema inyector y el detector.
Límite de detección |
Recomendación de gas |
Recomendación de regulador |
| Gas de purga | ||
| ≤ 1 ppm | Helio HiQ 5.0 | Serie BASELINE C106 |
El depósito contiene el disolvente, que se denomina fase móvil porque se mueve. Suele haber un mínimo de dos depósitos en un sistema, cada uno de los cuales contiene hasta 1000 cc de disolvente y suele estar equipado con un difusor de gas a través del cual se puede burbujear helio. Se utiliza una bomba para generar un flujo específico de la fase móvil. Aunque la inyección manual de las muestras sigue siendo posible, la mayoría de los HPLC están ahora totalmente automatizados y controlados por ordenador. El inyector, o muestreador automático, introduce el disolvente en una corriente de fase que lleva la muestra a la columna de alta presión (hasta 400 bares), que contiene el material de relleno específico necesario para efectuar la separación. El material de empaquetamiento se denomina fase estacionaria porque se mantiene en su lugar por el hardware de la columna.
Se necesita un detector para ver las bandas de compuestos separadas a medida que eluyen de la columna de alta presión. La información se envía desde el detector a un ordenador que genera el cromatograma. La fase móvil sale del detector y se envía a un residuo o se recoge, según se desee.
El rociado de helio es un método eficaz de desgasificación de la fase móvil para evitar líneas de base inestables causadas por el aire disuelto. El nitrógeno se utiliza como gas de nebulización en el detector de dispersión de luz por evaporación (ELSD), en el que el disolvente se evapora de la muestra dejando una niebla a medida que se mide.
Cromatografía líquida de alto rendimiento – Otros tipos de HPLC
Cromatografía líquida de ultra alto rendimiento (uHPLC):
Mientras que la HPLC estándar suele utilizar partículas de columna con tamaños de 3 a 5µm y presiones de unos 400 bares, la uHPLC utiliza columnas especialmente diseñadas con partículas de hasta 1,7µm de tamaño, a presiones superiores a 1000 bares. La principal ventaja de un uHPLC es la velocidad. Estos sistemas son más rápidos, más sensibles y dependen de volúmenes más pequeños de disolventes orgánicos que la HPLC estándar, lo que permite analizar más muestras en menos tiempo. Sin embargo, si los sistemas funcionan a presiones típicas superiores a 800 bares, las columnas envejecen o se degradan más rápidamente. Se está desarrollando una nueva tecnología para que las unidades de uHPLC utilicen partículas de columna con un tamaño de 1µm, y potenciales de presión de hasta 6.800 bares.
La uHPLC también se conoce como UPLCTM, una marca comercial de Waters Corporation.
Cromatografía líquida de proteínas rápida (FPLC):
La FPLC es un sistema similar a la cromatografía líquida de alto rendimiento que se utiliza para separar o purificar proteínas y otras biomoléculas de mezclas complejas. La principal diferencia entre la FPLC y la HPLC es la presión de trabajo estándar. Las columnas de FPLC sólo pueden utilizarse hasta presiones máximas de 3-5 MPa. Si se puede limitar la presión de la HPLC, casi todas las columnas de FPLC pueden utilizarse también en un sistema de HPLC.