Effets de dose et de temps de l’apport de caféine sur les récepteurs plaquettaires humains de l’adénosine A2A

La caféine, présente dans différentes sources telles que le café, le thé, le chocolat et les boissons au cola, est la substance active la plus répandue dans le monde. La consommation moyenne de caféine par les humains adultes varie selon les cultures et les nations de 80 à 400 mg par personne et par jour.1 La caféine suscite un nombre diversifié de réponses pharmacologiques, notamment une vigilance accrue, une diminution du temps de réaction psychomotrice et une augmentation de la latence du sommeil et du temps d’éveil, et peut également influencer les performances intellectuelles2. De plus, la caféine provoque la relaxation des muscles lisses, augmente la sécrétion d’acide gastrique et la libération de catécholamines, et accroît l’activité métabolique.3

Le ou les mécanismes précis qui sous-tendent les actions de la caféine restent mal définis. Bien que l’inhibition des phosphodiestérases puisse contribuer aux actions de la caféine,4 il est de plus en plus évident que la plupart des effets pharmacologiques de cette xanthine résultent de l’antagonisme des récepteurs de l’adénosine désignés comme sous-types A1, A2A, A2B et A3.5 La caféine agit le plus puissamment sur les récepteurs A2A, suivis de près par les récepteurs A1, puis les récepteurs A2B,6 et comme un faible antagoniste des récepteurs A3 humains. Le blocage par la caféine des récepteurs de l’adénosine, à savoir les types de récepteurs A1 et A2A, inhibe l’action de l’adénosine endogène sur une variété de processus physiologiques.7 Dans des conditions normales, les niveaux sanguins d’adénosine semblent être suffisants pour activer toniquement les récepteurs A2A dans les plaquettes. Récemment, il a été signalé que l’agrégation plaquettaire était accrue chez des souris privées de récepteurs A2A, ce qui indique l’importance de ce sous-type de récepteur dans la fonction plaquettaire8. Il est donc concevable que la caféine puisse bloquer ces récepteurs A2A toniquement activés dans les plaquettes et altérer leurs fonctions modulées par l’adénosine.

Pendant de nombreuses années, une association a été suspectée entre la consommation de café et les maladies cardiovasculaires, en particulier les maladies coronariennes,9 mais il a récemment été démontré que la consommation de café ou de caféine n’augmente pas le risque de maladies coronariennes ou d’accidents vasculaires cérébraux.1011 De nombreuses études épidémiologiques considérant l’infarctus du myocarde n’ont trouvé aucun effet délétère de <5 tasses de café par jour, alors que les résultats sont controversés à des niveaux de consommation plus élevés.12 Chez les patients souffrant d’hypertension, aucun risque d’issue défavorable n’a été observé, quel que soit le niveau de consommation de caféine.13

Une étude de Biaggioni et al14 a révélé qu’un régime de dosage répété de caféine entraîne des changements significatifs dans les plaquettes humaines en ce qui concerne les réponses fonctionnelles à l’agoniste des récepteurs de l’adénosine 5′-N-éthylcarboxamidoadénosine (NECA). Le retrait de la caféine produit un décalage significatif vers la gauche de l’inhibition de l’agrégation induite par la NECA14. En accord avec cela, nous avons récemment démontré,15 chez des sujets traités avec 750 mg/j pendant 1 semaine, que la prise chronique de caféine modifie l’agrégabilité plaquettaire en raison de la régulation à la hausse des récepteurs A2A situés à la surface des plaquettes.

Dans le présent article, nous fournissons des preuves supplémentaires qu’une réponse similaire est trouvée chez les sujets traités avec de la caféine à différentes doses, telles que 600 mg/j pendant 1 semaine ou 400 mg/j, administrée pendant une période plus longue, comme 2 semaines. Dans la présente étude, cela a été fait en mesurant directement les modifications des récepteurs A2A de l’adénosine (densité et affinité) et leur fonction en déterminant l’effet de l’agoniste sélectif A2A 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) pour (1) augmenter l’accumulation d’AMPc, (2) inhiber l’agrégation plaquettaire et (3) diminuer les niveaux de calcium intracellulaire. Après une consommation chronique (600 mg/j pendant 1 semaine ou 400 mg/j pendant 2 semaines), on a constaté une régulation positive des récepteurs plaquettaires de l’adénosine A2A, qui était fortement corrélée aux effets antiagrégants, à une augmentation de l’accumulation d’AMPc et à une diminution des niveaux de calcium intracellulaire. Aucune différence n’a été révélée sur les paramètres de liaison et fonctionnels des sujets traités par 400 mg/j pendant 1 semaine.

Méthodes

Quarante-cinq sujets sains, non fumeurs, âgés de 25 à 45 ans, des deux sexes, ont été étudiés. Après avoir donné un consentement éclairé écrit, les sujets ont été invités à s’abstenir de consommer des méthylxanthines alimentaires pendant ≥2 semaines. Ils ont été divisés en 3 groupes (15 sujets chacun) selon le schéma d’administration de la caféine (ie, dose et durée d’administration) : 200 mg par voie orale 2 fois par jour pendant une période de 7 jours (groupe 1) ; 200 mg par voie orale 2 fois par jour pendant une période de 14 jours (groupe 2) ; et 200 mg par voie orale 3 fois par jour pendant une période de 7 jours (groupe 3). Les plaquettes de ces sujets ont été étudiées avant qu’ils ne commencent à prendre de la caféine (jour 0) et à 1, 12, 60 et 108 heures après la dernière dose de caféine. En particulier, le point temporel de 1 heure a été étudié uniquement dans le groupe recevant la dose maximale de caféine (600 mg/j). La CE50 et la CI50 dans les essais fonctionnels n’ont pas pu être obtenues à 1 heure en raison des problèmes pratiques liés à une prise de sang excessive dans une période de temps étroite (1 à 12 heures).

Essai de liaison du SCH 58261 dans les membranes de plaquettes humaines

Les membranes de plaquettes humaines ont été préparées comme décrit précédemment16 et utilisées pour les essais de liaison de radioligands avec le SCH 58261 selon Varani et al.17. Dans les études de saturation, les membranes de plaquettes humaines ont été incubées avec 8 à 10 concentrations différentes de SCH 58261 allant de 0,01 à 10 nmol/L. La liaison non spécifique a été déterminée en présence de NECA 10 μmol/L. Après 60 minutes d’incubation à 4°C, les échantillons ont été filtrés sur des filtres Whatman GF/B avec un collecteur de cellules Micro-Mate 196 (Packard Instrument Co). Un programme d’ajustement de courbe des moindres carrés non linéaires pondérés, LIGAND,18 a été utilisé pour l’analyse informatique des données des expériences de saturation.

Mesure des niveaux d’AMPc dans les plaquettes humaines

Les plaquettes humaines lavées obtenues à partir du sang périphérique de volontaires sains ont été préparées comme décrit précédemment16. Les plaquettes (6×104 à 8×104 cellules) ont été incubées avec 1,0 U d’adénosine désaminase/mL, 0,5 mmol/L de 4-(3-butoxy-4-méthoxybenzyl)-2-imidazolidinone (Ro 20-1724) comme inhibiteur de la phosphodiestérase, et 6 à 8 concentrations différentes de HE-NECA. Les valeurs EC50 ont été obtenues à partir des courbes concentration-réponse après transformation log-logit des variables dépendantes par une méthode des moindres carrés pondérés.19 La solution aqueuse finale a été testée pour les niveaux d’AMPc par un test de compétition de liaison aux protéines.15

Dossier d’agrégation plaquettaire

Le sang humain citraté a été centrifugé à 200g pendant 10 minutes pour obtenir du plasma riche en plaquettes et à 2500g pendant 20 minutes pour obtenir du plasma pauvre en plaquettes. La numération des plaquettes humaines a été réalisée dans un compteur Coulter modèle S8/80 (Coulter Electronics Inc) et ajustée à 2,5×108/mL à 3,5×108/mL avec du plasma pauvre en plaquettes autologue. L’agrégation plaquettaire a été réalisée selon la technique turbidimétrique de Born20 avec un agrégateur DIC PA-3220 (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Après incubation pendant 3 minutes avec 6 à 8 concentrations différentes de HE-NECA, le plasma riche en plaquettes a été agrégé à 37°C sous agitation continue avec de l’ADP. Des expériences similaires ont été réalisées avec de l’ADP à différentes concentrations (100 nmol/L à 100 μmol/L). L’agrégation maximale, enregistrée 5 minutes après l’ajout d’ADP, a été utilisée pour l’analyse quantitative, et le pourcentage d’inhibition a été calculé par rapport aux valeurs de contrôle.21

Mesures de la concentration de Ca2+ libre cytoplasmique

La concentration de calcium libre cytosolique a été mesurée à l’aide de la technique fura 2 selon Paul et al.22. Brièvement, les plaquettes ont été incubées dans l’obscurité totale pendant 30 minutes à 37°C avec 1 μmol/L de fura 2-AM et agitées magnétiquement dans des cuvettes fluorimétriques (LS50, Perkin Elmer, Ltd) à une concentration de 108/mL en présence de 250 μmol/L de sulfinpyrazone. La concentration intracellulaire de Ca2+ (i) a été déterminée avec un rapport d’excitation de 340/380 et une longueur d’onde d’émission de 505 nm.

Analyse statistique

L’analyse des données a été effectuée par ANOVA à 1 voie. L’analyse de la différence entre les groupes traités à la caféine (12, 60 et 108 heures) et les sujets témoins a été effectuée par le test t de Student (analyse non appariée). Les différences ont été considérées comme significatives à une valeur de P<0,01. Toutes les données sont rapportées en moyenne±SEM.

Résultats

Les plaquettes des 3 groupes de sujets ont été récoltées avant le début de l’administration de caféine (jour 0, contrôle) et à 1, 12, 60 et 108 heures après la dernière dose (retrait de la caféine). Le tableau résume les résultats des expériences de liaison et fonctionnelles des 3 groupes de sujets.

Groupe 1 (400 mg/j pendant 1 semaine)

Les paramètres de liaison ont révélé une valeur Bmax de contrôle de 105±6 fmol/mg de protéine et une valeur KD de 1,28±0,08 nmol/L. Dans les plaquettes témoins, l’HE-NECA a augmenté les niveaux d’AMPc avec une CE50 de 60±5 nmol/L et a inhibé (1) l’agrégation avec une IC50 de 86±10 nmol/L et (2) les niveaux de calcium avec une IC50 de 104±8 nmol/L. Aucune différence statistiquement significative n’a été trouvée dans les paramètres de liaison et fonctionnels 12, 60 et 108 heures après le retrait de la caféine (tableau).

Groupe 2 (400 mg/j pendant 2 semaines)

Les paramètres de liaison ont révélé une valeur Bmax de contrôle de 110±3 fmol/mg de protéine et une valeur KD de 1,21±0,09 nmol/L. 12 et 60 heures après le retrait de la caféine, les densités de récepteurs, Bmax, ont augmenté aux deux points de temps d’environ 20 %, mais les valeurs KD sont restées inchangées. Les expériences fonctionnelles ont révélé que l’agoniste du récepteur A2A de l’adénosine HE-NECA était significativement plus puissant pour augmenter l’AMPc plaquettaire (c’est-à-dire que les valeurs de la CE50 étaient 45% et 65% plus petites à 12 et 60 heures après le retrait de la caféine que les valeurs de contrôle, respectivement). Une tendance similaire a été observée dans les valeurs de la CI50 obtenues dans les expériences d’agrégation et dans les mesures de la concentration de calcium libre cytoplasmique (Tableau).

Groupe 3 (600 mg/j pendant 1 semaine)

Dans l’ensemble, nous avons obtenu des données similaires à celles du groupe 2. Le SCH 58261 s’est lié à une seule classe d’affinité de sites dans les membranes plaquettaires des témoins avec une Bmax de 100±4 fmol/mg de protéine et une KD de 1,27±0,09 nmol/L. Comme le montre la figure 1A, dans les membranes de plaquettes prélevées 1, 12, 60 et 108 heures après le retrait de la caféine, le radioligand s’est lié avec la même affinité, mais le nombre de sites de liaison (Bmax) a augmenté de façon significative (P<0,01). Dans des études parallèles, les réponses fonctionnelles des plaquettes à l’agoniste du récepteur A2A HE-NECA ont été déterminées. Comme le résume le tableau, la puissance de l’HE-NECA pour (1) augmenter la formation d’AMPc, (2) inhiber l’agrégation plaquettaire induite par l’ADP et (3) diminuer les niveaux de calcium était significativement accrue dans les plaquettes obtenues 12, 60 et 108 heures après le retrait de la caféine (Figure 1B, 1C et 1D). Des expériences ont également été menées pour déterminer si l’augmentation de la densité des récepteurs A2A s’accompagnerait d’une diminution de la puissance et/ou de l’efficacité de l’ADP pour induire l’agrégation. Les valeurs EC50 de l’ADP pour stimuler l’agrégation plaquettaire 12, 60 et 108 heures après le retrait de la caféine étaient respectivement de 0,7±0,2, 0,9±0,1 et 0,8±0,1 μmol/L, valeurs non significativement différentes des 0,9±0.2 μmol/L obtenues dans les plaquettes de témoins (figure 2).

Discussion

Les effets de l’administration à long terme de caféine chez l’homme et l’animal et son rôle dans leur tolérance aux actions de la caféine sont controversés. Certaines études montrant une augmentation des récepteurs A1 dans le cerveau des souris ont trouvé des preuves d’une upregulation dose-dépendante des récepteurs A1 par la caféine.23 D’autres études ont révélé une upregulation des récepteurs A2A, suggérant un effet adaptatif de la prise de caféine.24 De plus, la consommation chronique de caféine peut conduire à une réduction de l’agrégabilité plaquettaire en raison de l’upregulation des récepteurs A2A situés à la surface des plaquettes14 jouant un rôle potentiel dans les processus physiopathologiques, tels que l’agrégation et la thrombogenèse. Bien que ces changements puissent contribuer aux altérations de la fonction plaquettaire, la tolérance à la caféine ne modifie pas la puissance de cette xanthine en tant qu’antagoniste compétitif des effets de l’adénosine.25 D’autres changements, tels que le déplacement de l’affinité des récepteurs vers un état de haute affinité, des altérations des niveaux de protéines G ou du couplage de ces protéines aux récepteurs de l’adénosine, ou l’occupation à long terme des récepteurs peuvent être impliqués dans le phénomène de tolérance.26 Les symptômes de sevrage de la caféine se manifestent chez l’homme ; il s’agit généralement de maux de tête, de fatigue, d’apathie et de somnolence.9 En particulier, la caféine augmente la concentration plasmatique d’adénosine, et sa réduction après le retrait de l’antagoniste suggère une régulation de la concentration plasmatique d’adénosine médiée par les récepteurs.27 Pendant l’ischémie et/ou l’hypoxie, l’adénosine a également des actions neuroprotectrices. Dans le cerveau adulte, le traitement chronique à la caféine, qui entraîne une régulation à la hausse des récepteurs de l’adénosine, réduit les lésions ischémiques, tandis que l’exposition aiguë (effet antagoniste des récepteurs) augmente les lésions ischémiques.28

Il a été démontré que la prise chronique de caféine modifie la réponse des plaquettes aux actions de l’adénosine.14 L’administration répétée de caféine (750 mg/j pendant 1 semaine) a révélé une augmentation de la densité des récepteurs A2A, accompagnée d’une sensibilisation des réponses plaquettaires, telles qu’une augmentation de l’accumulation d’AMPc et une diminution de l’agrégation plaquettaire.15 L’objectif de la présente étude était de déterminer l’effet du dosage de la caféine et de la durée d’administration sur les paramètres de liaison et fonctionnels. Nous avons donc étudié les changements de la densité et de l’affinité des récepteurs A2A de l’adénosine dans les membranes de plaquettes humaines de sujets traités avec différentes doses (400 ou 600 mg/j) pendant différentes périodes de prise de caféine (1 ou 2 semaines). Plus précisément, nous avons étudié des sujets témoins (avant l’administration de caféine) et des sujets traités par la caféine (1, 12, 60 et 108 heures après la dernière dose de caféine).

Le traitement par 400 mg/j de caféine pendant 1 semaine n’a pas modifié les paramètres de liaison et de fonctionnement des récepteurs A2A. Cependant, le traitement par 400 mg/j pendant 2 semaines ou 600 mg/j pendant 1 semaine a entraîné (1) une augmentation significative (upregulation) des sites de liaison à l’adénosine A2A, (2) une augmentation de l’accumulation d’AMPc, (3) une augmentation des effets antiagrégants, et (4) une diminution des niveaux de calcium provoqués par l’agoniste des récepteurs A2A HE-NECA.

L’upregulation des récepteurs A2A peut probablement être attribuée à la synthèse de nouveaux récepteurs pendant la différenciation des cellules précurseurs. Cette interprétation est basée sur les résultats d’expériences in vitro montrant que l’incubation du plasma riche en plaquettes de sujets témoins pendant une période de 6 ou 12 heures avec de la caféine ou du SCH 58261 n’a pas affecté les paramètres de liaison.15 La régulation à la hausse des récepteurs A2A de l’adénosine provoquée par la prise chronique de caféine pourrait être interprétée comme indiquant que l’adénosine endogène exerce une influence tonique sur les plaquettes humaines et que la présence de l’antagoniste est contrebalancée par la régulation à la hausse des récepteurs A2A. Chez les adultes, la caféine est adsorbée efficacement à partir du tractus gastro-intestinal ; les concentrations plasmatiques maximales sont atteintes 15 à 120 minutes après l’ingestion, et la demi-vie de la caféine est de 2,5 à 4,5 heures7. L’augmentation des récepteurs A2A de l’adénosine constatée 1 heure après la dernière dose de traitement à la caféine était similaire à celle obtenue 12 ou 60 heures après le retrait de la caféine, ce qui montre que le retrait n’était pas nécessaire pour la régulation ascendante des récepteurs A2A.

Un autre objectif de la présente étude était de déterminer si les modifications des paramètres de liaison étaient corrélées aux modifications de la ou des réponses fonctionnelles. Il a été constaté que l’agrégation plaquettaire était associée à une activation de l’adénylate cyclase et à une augmentation des concentrations de calcium intracellulaire. L’activité de l’HE-NECA 12, 60 et 108 heures après le retrait de la caféine était significativement accrue par rapport au groupe témoin. Cette découverte indique que l’administration répétée de différentes doses de caféine entraîne des changements significatifs du nombre de récepteurs A2A à la surface des plaquettes, accompagnés d’une réactivité accrue à la stimulation des récepteurs. Le récepteur A2A classique de l’adénosine est responsable des propriétés antiagrégantes de l’adénosine et de ses analogues, ce qui est cohérent avec l’observation selon laquelle l’agrégation est plus efficace chez les souris dépourvues des récepteurs A2A.8 Cependant, l’agrégation plaquettaire induite par des concentrations croissantes d’ADP n’était pas significativement différente entre les sujets témoins et ceux traités par la caféine. Une explication possible de cette dernière observation est que l’adénosine n’est pas présente en quantité suffisante dans le milieu de test pour produire une réponse. Par ailleurs, chez les sujets traités à la caféine, l’ampleur de la régulation positive des récepteurs (c’est-à-dire le nombre de récepteurs) n’était pas suffisante pour produire un déplacement de la courbe concentration-réponse de l’agrégation induite par l’ADP. Cependant, lorsque les niveaux d’adénosine endogène augmentent, comme pendant l’ischémie myocardique, la concentration extracellulaire d’adénosine s’élève rapidement à un niveau suffisant pour agir sur les récepteurs régulés et peut avoir des effets inhibiteurs plaquettaires plus importants que le contrôle. Ainsi, il est possible que la consommation chronique de caféine à des doses non éloignées de l’apport alimentaire moyen puisse conduire à une réduction paradoxale de l’agrégabilité plaquettaire au cours de l’ischémie.

En conclusion, l’ensemble des données fournit des preuves supplémentaires que la consommation chronique de caféine modifie la réponse des plaquettes aux actions de l’adénosine. La principale conclusion de la présente étude est que les effets de la consommation chronique de caféine sur les fonctions plaquettaires dépendent à la fois de la dose et de la durée du traitement et sous-tendent une réduction de l’agrégabilité plaquettaire due à l’upregulation des récepteurs A2A de l’adénosine.

Footnotes