La chromatographie liquide à haute performance (HPLC) est une forme de chromatographie sur colonne qui pompe un mélange d’échantillons ou un analyte dans un solvant (appelé phase mobile) à haute pression à travers une colonne avec un matériau de garnissage chromatographique (phase stationnaire). L’échantillon est transporté par un courant de gaz porteur mobile d’hélium ou d’azote. La CLHP a la capacité de séparer et d’identifier les composés présents dans tout échantillon pouvant être dissous dans un liquide, à des concentrations aussi faibles que des parties par trillion. En raison de cette polyvalence, la CLHP est utilisée dans une variété d’applications industrielles et scientifiques, telles que les applications pharmaceutiques, environnementales, médico-légales et chimiques.
Le temps de rétention de l’échantillon varie en fonction de l’interaction entre la phase stationnaire, les molécules analysées et le ou les solvants utilisés. Lorsque l’échantillon traverse la colonne, il interagit entre les deux phases à une vitesse différente, principalement en raison des différentes polarités des analytes. Les analytes qui ont le moins d’interaction avec la phase stationnaire ou le plus d’interaction avec la phase mobile sortiront plus rapidement de la colonne.
Instrumentation:
Les principaux composants d’un système HPLC comprennent le réservoir de solvant, ou plusieurs réservoirs, une pompe haute pression, une colonne, un système d’injection et le détecteur.
Limite de détection |
Recommandation de gaz |
Recommandation de régulateur |
| Gaz de purge | ||
| ≤ 1 ppm | Hélium HiQ 5.0 | BASELINE C106 series |
Le réservoir contient le solvant, qui est appelé phase mobile parce qu’il se déplace. Il y a généralement un minimum de deux réservoirs dans un système, chacun pouvant contenir jusqu’à 1000 cc de solvant et étant généralement équipé d’un diffuseur de gaz à travers lequel on peut faire barboter de l’hélium. Une pompe est utilisée pour générer un débit spécifique de la phase mobile. Bien que l’injection manuelle des échantillons soit encore possible, la plupart des HPLC sont désormais entièrement automatisés et contrôlés par ordinateur. L’injecteur, ou échantillonneur automatique, introduit le solvant dans un flux de phase qui transporte l’échantillon dans la colonne à haute pression (jusqu’à 400 bars), qui contient un matériau de garnissage spécifique nécessaire pour effectuer la séparation. Le matériau de garnissage est appelé phase stationnaire car il est maintenu en place par le matériel de la colonne.
Un détecteur est nécessaire pour voir les bandes de composés séparés lorsqu’ils éluent de la colonne haute pression. L’information est envoyée du détecteur à un ordinateur qui génère le chromatogramme. La phase mobile sort du détecteur et est soit envoyée vers un déchet, soit collectée, comme on le souhaite.
L’aspersion d’hélium est une méthode efficace pour dégazer la phase mobile afin d’éviter les lignes de base instables causées par l’air dissous. L’azote est utilisé comme gaz de nébulisation dans le détecteur de diffusion de lumière par évaporation (ELSD) où le solvant est évaporé de l’échantillon en laissant un brouillard qui est mesuré.
Chromatographie liquide à haute performance – Autres types de CLHP
Chromatographie liquide à ultra-haute performance (uHPLC):
Alors que la CLHP standard utilise généralement des particules de colonne de 3 à 5µm et des pressions d’environ 400 bars, l’uHPLC utilise des colonnes spécialement conçues avec des particules d’une taille allant jusqu’à 1,7µm, à des pressions supérieures à 1000 bars. Le principal avantage d’une uHPLC est la vitesse. Ces systèmes sont plus rapides, plus sensibles et utilisent de plus petits volumes de solvants organiques que la CLHP standard, ce qui permet d’analyser plus d’échantillons en moins de temps. Cependant, si les systèmes fonctionnent à des pressions typiques supérieures à 800 bars, les colonnes vieillissent ou se dégradent plus rapidement. Une technologie plus récente est en cours de développement pour les unités uHPLC afin d’utiliser des particules de colonne d’une taille de 1µm, et des potentiels de pression allant jusqu’à 6 800 bars.
La uHPLC est également connue sous le nom d’UPLCTM, une marque déposée de la Waters Corporation.
Chromatographie liquide rapide des protéines (FPLC):
La FPLC est un système similaire à la chromatographie liquide à haute performance qui est utilisé pour séparer ou purifier les protéines et autres biomolécules à partir de mélanges complexes. La principale différence entre la FPLC et la HPLC est la pression de travail standard. Les colonnes FPLC ne peuvent être utilisées que jusqu’à des pressions maximales de 3-5 MPa. Si la pression de l’HPLC peut être limitée, presque toutes les colonnes FPLC peuvent également être utilisées dans un système HPLC.