Wysokowydajna chromatografia cieczowa (HPLC) jest formą chromatografii kolumnowej, która pompuje mieszaninę próbek lub analitów w rozpuszczalniku (zwanym fazą ruchomą) pod wysokim ciśnieniem przez kolumnę z materiałem chromatograficznym (fazą stacjonarną). Próbka jest przenoszona przez poruszający się strumień gazu nośnego – helu lub azotu. HPLC ma zdolność rozdzielania i identyfikowania związków, które są obecne w każdej próbce, która może być rozpuszczona w cieczy, w stężeniach śladowych, tak niskich jak części na bilion. Ze względu na tę wszechstronność, HPLC jest używana w wielu zastosowaniach przemysłowych i naukowych, takich jak farmacja, ochrona środowiska, kryminalistyka i chemia.
Czas retencji próbki jest różny w zależności od interakcji pomiędzy fazą stacjonarną, analizowanymi cząsteczkami i rozpuszczalnikiem lub rozpuszczalnikami. Gdy próbka przechodzi przez kolumnę, wchodzi w interakcje pomiędzy dwoma fazami w różnym tempie, głównie z powodu różnej polarności analitów. Anality, które mają najmniejszą ilość interakcji z fazą stacjonarną lub największą ilość interakcji z fazą ruchomą, opuszczą kolumnę szybciej.
Instrumentacja:
Główne składniki systemu HPLC obejmują zbiornik rozpuszczalnika lub wiele zbiorników, pompę wysokociśnieniową, kolumnę, system wtryskiwaczy i detektor.
Granica detekcji |
Zalecenie dotyczące gazu |
Zalecenie dotyczące regulatora |
| Gaz oczyszczający | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 series |
W zbiorniku znajduje się rozpuszczalnik, który jest nazywany fazą ruchomą, ponieważ się porusza. Zwykle w układzie znajdują się minimum dwa zbiorniki, z których każdy mieści do 1000 cm3 rozpuszczalnika i zwykle jest wyposażony w dyfuzor gazowy, przez który może być wydmuchiwany hel. Pompa jest używana do generowania określonego przepływu fazy ruchomej. Chociaż nadal możliwe jest ręczne wstrzykiwanie próbek, większość HPLC jest obecnie w pełni zautomatyzowana i sterowana komputerowo. Wstrzykiwacz lub automatyczny próbnik wprowadza rozpuszczalnik do strumienia fazy, który przenosi próbkę do wysokociśnieniowej (do 400 bar) kolumny, która zawiera specyficzny materiał uszczelniający potrzebny do przeprowadzenia rozdzielenia. Materiał uszczelniający jest określany jako faza stacjonarna, ponieważ jest on utrzymywany w miejscu przez osprzęt kolumny.
Detektor jest potrzebny, aby zobaczyć oddzielone pasma związków w miarę ich elucji z kolumny wysokociśnieniowej. Informacja jest wysyłana z detektora do komputera, który generuje chromatogram. Faza ruchoma opuszcza detektor i jest albo wysyłana do odpadów, albo zbierana, zgodnie z życzeniem.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa – inne typy HPLC
Ultra wysokosprawna chromatografia cieczowa (uHPLC):
Podczas gdy standardowa HPLC zazwyczaj wykorzystuje cząsteczki kolumn o rozmiarach od 3 do 5 µm i ciśnieniu około 400 barów, uHPLC wykorzystuje specjalnie zaprojektowane kolumny z cząsteczkami o rozmiarach do 1,7 µm, przy ciśnieniu przekraczającym 1000 barów. Główną zaletą uHPLC jest szybkość. Systemy te są szybsze, bardziej czułe i wykorzystują mniejsze objętości rozpuszczalników organicznych niż standardowe HPLC, co pozwala na wykonanie większej ilości próbek w krótszym czasie. Jednakże, jeśli systemy te pracują pod typowym ciśnieniem większym niż 800 barów, kolumny szybciej się starzeją lub ulegają degradacji. W jednostkach uHPLC opracowywana jest nowsza technologia wykorzystująca cząsteczki kolumn o wielkości 1µm i potencjale ciśnieniowym do 6 800 barów.
uHPLC jest również znana jako UPLCTM, znak towarowy firmy Waters Corporation.
Szybka chromatografia cieczowa białek (FPLC):
FPLC to system podobny do wysokosprawnej chromatografii cieczowej, który jest używany do rozdzielania lub oczyszczania białek i innych biomolekuł ze złożonych mieszanin. Główną różnicą pomiędzy FPLC a HPLC jest standardowe ciśnienie robocze. Kolumny FPLC mogą być używane tylko do maksymalnych ciśnień 3-5 MPa. Jeśli ciśnienie HPLC może być ograniczone, prawie każda kolumna FPLC może być również użyta w systemie HPLC.