RuBisCO

RuBisCO jest jednym z wielu enzymów w cyklu Calvina. Gdy Rubisco ułatwia atak CO2 na węgiel C2 RuBP, a następnie rozszczepienie wiązania między węglem C3 i C2, powstają 2 cząsteczki gliceryno-3-fosforanu. Konwersja obejmuje następujące etapy: enolizację, karboksylację, hydratację, rozszczepienie wiązania C-C i protonację.

SubstratyEdit

Substratami dla RuBisCO są rybuloza-1,5-bisfosforan i dwutlenek węgla (różny od „aktywującego” dwutlenku węgla). RuBisCO katalizuje również reakcję rybulozo-1,5-bisfosforanu i tlenu cząsteczkowego (O
2) zamiast dwutlenku węgla (CO
2).Rozróżnianie pomiędzy substratami CO2 i O2 przypisuje się różnym oddziaływaniom momentów kwadrupolowych substratów i wysokiemu gradientowi pola elektrostatycznego. Ten gradient jest ustanowiony przez formę dimeru minimalnie aktywnego RuBisCO, który ze swoimi dwoma składnikami zapewnia kombinację przeciwnie naładowanych domen wymaganych do interakcji enzymu z O2 i CO
2. Te warunki pomagają wyjaśnić niską szybkość obrotu znalezioną w RuBisCO: Aby zwiększyć siłę pola elektrycznego niezbędnego do wystarczającej interakcji z momentami kwadrupolowymi substratów, C- i N-końcowe segmenty enzymu muszą być zamknięte, co pozwala na odizolowanie miejsca aktywnego od rozpuszczalnika i obniżenie stałej dielektrycznej. Izolacja ta ma znaczący koszt entropowy i skutkuje niską szybkością obrotu.

Wiązanie RuBPEdit

Karbamylacja grupy ε-aminowej Lys201 jest stabilizowana przez koordynację z Mg2+. Reakcja ta polega na związaniu karboksylanowych zakończeń Asp203 i Glu204 z jonem Mg2+. Substrat RuBP wiąże Mg2+ wypierając dwa z trzech ligandów aquo.

EnolizacjaEdit

Enolizacja RuBP to konwersja tautomeru ketonowego RuBP do enediolu(ate). Enolizacja jest inicjowana przez deprotonację przy C3. Baza enzymatyczna w tym etapie była przedmiotem dyskusji, ale ograniczenia steryczne obserwowane w strukturach krystalicznych uczyniły Lys201 najbardziej prawdopodobnym kandydatem. W szczególności, tlen karbaminianowy na Lys201, który nie jest skoordynowany z jonem Mg, deprotonuje węgiel C3 RuBP, tworząc 2,3-enediolan.

KarboksylacjaEdit

Karboksylacja 2,3-enediolanu skutkuje pośrednim 3-keto-2′-karboksyarabinitol-1,5-bisfosforanem, a Lys334 jest ustawiony tak, aby ułatwić dodanie substratu CO2, ponieważ zastępuje trzecią cząsteczkę wody skoordynowaną z Mg2+ i dodać bezpośrednio do enediolu. W tym procesie nie tworzy się kompleks Michaelisa. W wyniku hydratacji tego ketonu powstaje dodatkowa grupa hydroksylowa na C3, tworząc półprodukt gem-diol. Zaproponowano, aby karboksylacja i hydratacja zachodziły jako jeden wspólny etap lub jako dwa etapy sekwencyjne. Mechanizm koncertowy jest wspierany przez bliskość cząsteczki wody do C3 RuBP w wielu strukturach krystalicznych. W strukturze szpinaku inne reszty są dobrze umieszczone, aby pomóc w kroku hydratacji, ponieważ znajdują się w odległości wiązania wodorowego od cząsteczki wody.

Rozszczepienie wiązania C-CEdit

Pośredni gem-diol rozszczepia się przy wiązaniu C2-C3, tworząc jedną cząsteczkę gliceryno-3-fosforanu i ujemnie naładowanego karboksylanu. Stereospecyficzna protonacja C2 tego karbanionu powoduje powstanie kolejnej cząsteczki glicerynianu-3-fosforanu. Uważa się, że ten etap jest ułatwiany przez Lys175 lub potencjalnie karbamylowaną Lys201.

ProductsEdit

Gdy dwutlenek węgla jest substratem, produktem reakcji karboksylazy jest niestabilny sześciowęglowy fosforylowany pośredni znany jako 3-keto-2-karboksyarabinitol-1,5-bisfosforan, który szybko rozpada się na dwie cząsteczki glicerynianu-3-fosforanu. 3-fosfoglicerynian może być użyty do produkcji większych cząsteczek, takich jak glukoza.

Działania uboczne Rubisco mogą prowadzić do bezużytecznych lub hamujących produktów ubocznych; jednym z takich produktów jest ksylulozo-1,5-bisfosforan, który hamuje aktywność Rubisco.

Gdy tlen cząsteczkowy jest substratem, produktami reakcji oksygenazy są fosfoglikolan i 3-fosfoglicerynian. Fosfoglikolan jest utylizowany w sekwencji reakcji zwanej fotorespiracją, w której biorą udział enzymy i cytochromy znajdujące się w mitochondriach i peroksysomach (jest to przypadek naprawy metabolitów). W tym procesie dwie cząsteczki fosfoglikolanu są przekształcane w jedną cząsteczkę dwutlenku węgla i jedną cząsteczkę 3-fosfoglicerynianu, które mogą ponownie wejść do cyklu Calvina. Część fosfoglikolanu wchodzącego w tę ścieżkę może być zatrzymana przez rośliny do produkcji innych cząsteczek, takich jak glicyna. Przy poziomie dwutlenku węgla i tlenu w otoczeniu, stosunek reakcji wynosi około 4 do 1, co skutkuje wiązaniem dwutlenku węgla netto na poziomie tylko 3,5. Tak więc niezdolność enzymu do zapobiegania reakcji z tlenem znacznie zmniejsza zdolność fotosyntetyczną wielu roślin. Niektóre rośliny, wiele alg i bakterii fotosyntetyzujących przezwyciężyły to ograniczenie poprzez opracowanie środków zwiększających stężenie dwutlenku węgla wokół enzymu, włączając w to wiązanie węgla C4, metabolizm kwasów krassulowych i stosowanie pyrenoidów.

Szybkość aktywności enzymatycznejEdit

Niektóre enzymy mogą przeprowadzać tysiące reakcji chemicznych w każdej sekundzie. Jednak RuBisCO jest powolny, wiążąc tylko 3-10 cząsteczek dwutlenku węgla w każdej sekundzie na cząsteczkę enzymu. Reakcja katalizowana przez RuBisCO jest więc głównym czynnikiem ograniczającym tempo cyklu Calvina w ciągu dnia. Niemniej jednak, w większości warunków i gdy światło nie ogranicza fotosyntezy, szybkość RuBisCO odpowiada pozytywnie na rosnące stężenie dwutlenku węgla.

RuBisCO jest zwykle aktywna tylko w ciągu dnia, ponieważ rybuloza 1,5-bisfosforan nie jest regenerowana w ciemności. Wynika to z regulacji kilku innych enzymów w cyklu Calvina. Ponadto, aktywność RuBisCO jest skoordynowana z aktywnością innych enzymów cyklu Calvina na kilka innych sposobów:

Przez jonyEdit

Po oświetleniu chloroplastów, pH zrębu wzrasta z 7,0 do 8,0 z powodu gradientu protonów (jonów wodorowych, H+
) utworzonego w poprzek błony tylakoidu. Ruch protonów do tylakoidów jest napędzany przez światło i ma zasadnicze znaczenie dla syntezy ATP w chloroplastach (Dalsza lektura: Fotosyntetyczne centrum reakcji; Reakcje zależne od światła). Aby zrównoważyć potencjał jonowy przez błonę, jony magnezu (Mg2+
) w odpowiedzi przemieszczają się z tylakoidów, zwiększając stężenie magnezu w zrębie chloroplastów. RuBisCO ma wysokie optymalne pH (może wynosić >9,0, w zależności od stężenia jonów magnezu) i w ten sposób staje się „aktywowany” przez wprowadzenie dwutlenku węgla i magnezu do miejsc aktywnych, jak opisano powyżej.

Przez aktywazę RuBisCOEdit

W roślinach i niektórych algach, inny enzym, aktywaza RuBisCO (Rca, GO:0046863, P10896), jest wymagany, aby umożliwić szybkie tworzenie krytycznego karbaminianu w miejscu aktywnym RuBisCO. Jest to konieczne, ponieważ rybulozo-1,5-bisfosforan (RuBP) wiąże się silniej do miejsc aktywnych RuBisCO, gdy obecny jest nadmiar karbaminianu, uniemożliwiając postęp procesów. W świetle, aktywaza RuBisCO promuje uwalnianie hamującego (lub – w niektórych poglądach – magazynującego) RuBP z miejsc katalitycznych RuBisCO. Aktywaza jest również wymagana u niektórych roślin (np. u tytoniu i wielu fasoli), ponieważ w ciemności RuBisCO jest hamowana (lub chroniona przed hydrolizą) przez konkurencyjny inhibitor syntetyzowany przez te rośliny, analog substratu – 1-fosforan 2-karboksy-D-arabitinolu (CA1P). CA1P wiąże się ściśle do miejsca aktywnego karbamylowanego RuBisCO i w jeszcze większym stopniu hamuje aktywność katalityczną. Wykazano również, że CA1P utrzymuje RuBisCO w konformacji, która jest chroniona przed proteoliz±. W ¶wietle aktywaza RuBisCO promuje również uwalnianie CA1P z miejsc katalitycznych. Po uwolnieniu CA1P z RuBisCO, jest on szybko przekształcany do postaci nieinhibicyjnej przez aktywowaną światłem fosfatazę CA1P. Nawet bez tych silnych inhibitorów, raz na kilkaset reakcji, normalne reakcje z dwutlenkiem węgla lub tlenem nie zostają zakończone; w miejscu aktywnym powstają jeszcze inne, hamujące analogi substratów. Ponownie, aktywaza RuBisCO może promować uwalnianie tych analogów z miejsc katalitycznych i utrzymywać enzym w formie katalitycznie aktywnej. Jednakże, w wysokich temperaturach aktywator RuBisCO agreguje i nie jest już w stanie aktywować RuBisCO. Przyczynia się to do zmniejszonej zdolności karboksylacyjnej obserwowanej podczas stresu cieplnego.

Przez ATP/ADP i stan redukcji/utleniania zrębu przez aktywazęEdit

Usuwanie hamujących RuBP, CA1P i innych hamujących analogów substratów przez aktywazę wymaga zużycia ATP. Reakcja ta jest hamowana przez obecność ADP, a zatem aktywność aktywazy zależy od proporcji tych związków w zrębie chloroplastu. Co więcej, u większości roślin wrażliwość aktywazy na stosunek ATP/ADP jest modyfikowana przez stan redukcji/utleniania (redoks) zrębu za pośrednictwem innego małego białka regulatorowego, tioredoksyny. W ten sposób aktywność aktywazy i stan aktywacji RuBisCO mogą być modulowane w odpowiedzi na intensywność światła, a tym samym szybkość tworzenia substratu rybulozy 1,5-bisfosforanu.

Przez fosforanEdit

W sinicach, nieorganiczny fosforan (Pi) również uczestniczy w skoordynowanej regulacji fotosyntezy: Pi wiąże się do miejsca aktywnego RuBisCO oraz do innego miejsca na dużym łańcuchu, gdzie może wpływać na przejścia pomiędzy aktywowanymi i mniej aktywnymi konformacjami enzymu. W ten sposób aktywacja bakteryjnego RuBisCO może być szczególnie wrażliwa na poziom Pi, co może spowodować, że będzie ona działać w sposób podobny do tego, jak aktywaza RuBisCO funkcjonuje u roślin wyższych.

Przez dwutlenek węglaEdit

Ponieważ dwutlenek węgla i tlen konkurują w miejscu aktywnym RuBisCO, wiązanie węgla przez RuBisCO może być wzmocnione przez zwiększenie poziomu dwutlenku węgla w przedziale zawierającym RuBisCO (zrębie chloroplastu). Kilkakrotnie w trakcie ewolucji roślin wykształciły się mechanizmy zwiększające poziom dwutlenku węgla w zrębie (patrz wiązanie węgla C4). Wykorzystanie tlenu jako substratu wydaje się być zastanawiającym procesem, ponieważ wydaje się wyrzucać przechwyconą energię. Może to być jednak mechanizm zapobiegający przeciążeniu węglowodanowemu w okresach wysokiego strumienia światła. Ta słabość enzymu jest przyczyną fotorespiracji, tak że zdrowe liście w jasnym świetle mogą mieć zerową wiązanie węgla netto, gdy stosunek O
2 do CO
2 dostępnego dla RuBisCO przesunie się zbyt daleko w kierunku tlenu. Zjawisko to jest przede wszystkim zależne od temperatury: Wysoka temperatura może obniżyć stężenie CO
2 rozpuszczonego w wilgoci tkanek liści. Zjawisko to jest również związane ze stresem wodnym: Ponieważ liście roślin są chłodzone ewaporacyjnie, ograniczona ilość wody powoduje wysoką temperaturę liści. Rośliny C4 początkowo wykorzystują enzym karboksylazę PEP, która ma większe powinowactwo do CO
2. W procesie tym najpierw powstaje 4-węglowy związek pośredni, który jest przenoszony do miejsca fotosyntezy C3, a następnie ulega dekarboksylacji, uwalniając CO
2, co zwiększa stężenie CO
2, stąd nazwa rośliny C4.

Rośliny o metabolizmie kwasów trawiennych (CAM) utrzymują swoje stomaty zamknięte w ciągu dnia, co pozwala zachować wodę, ale zapobiega zachodzeniu reakcji niezależnych od światła (a.k.a. Cykl Calvina), ponieważ reakcje te wymagają CO
2, aby przejść przez wymianę gazową przez te otwory. Parowanie przez górną stronę liścia jest uniemożliwione przez warstwę wosku.

.