Postkopulacyjna selekcja płciowa wpływa na ewolucję baculum u naczelnych i mięsożerców

Wprowadzenie

Morfologia męskich narządów intromitentnych jest argumentowana jako podlegająca szybszej ewolucji niż jakakolwiek inna forma w królestwie zwierząt. Wahadło, czyli kość prącia, nie ulega tej tendencji i została opisana jako „najbardziej zróżnicowana ze wszystkich kości” (, str. 1), różniąca się dramatycznie pod względem długości, szerokości i kształtu u ssaków.

Wahadło nie jest jednolicie obecne u ssaków. Sądzono, że występuje tylko u ośmiu rzędów ssaków: Afrosoricida, Carnivora, Chiroptera, Dermoptera, Erinaceomorpha, Primates, Rodentia i Soricomorpha . Jednak niedawno odkryto, że Lagomorph, amerykańska pika (Ochonta princeps), również ma małe baculum . Odkrycie to sugeruje, że obecność baculum może być bardziej powszechna u ssaków niż historycznie zakładano. W niektórych rzędach występuje mieszanka obecności i braku baculum u poszczególnych gatunków; są to Carnivora, Chiroptera, Primates i Rodentia. U naczelnych, na przykład u ludzi, tarsierów i kilku Platyrrhines brak jest baculum. Podobnie można podzielić Lagomorphia. Poza udokumentowaniem obecności i braku baculum u ssaków, historia ewolucji baculum nie była badana do niedawna, pozostawiając wiele pytań bez odpowiedzi.

Morfologia narządów płciowych (a więc i baculum) jest sugerowana jako podlegająca selekcji płciowej. Nieliczne testy empiryczne przeprowadzone do tej pory mogą wspierać tę hipotezę. Stockley i in. stwierdzili, że szerokość baculum u poligamicznych myszy domowych (Mus domesticus) była istotnym predyktorem sukcesu reprodukcyjnego samców. Simmons & Firman byli w stanie eksperymentalnie manipulować szerokością baculum poprzez zmianę poziomu presji selekcji płciowej w populacjach myszy domowych. Po 27 pokoleniach, populacje ze sztucznie wymuszonym wysokim poziomem postkopulacyjnej presji selekcji seksualnej miały znacznie grubsze bacula niż populacje, w których monogamia była wymuszona, a presja selekcji seksualnej była zatem nieobecna. Badania te wskazują, że selekcja wewnątrzpłciowa, w szczególności postkopulacyjna presja selekcyjna, może być motorem ewolucji bekereli. Jeśli tak jest, bacula populacji o wysokim poziomie wewnątrzpłciowej presji selekcyjnej, takich jak te z poligamicznymi (wielomęskimi, wielomęskimi) lub sezonowymi systemami krycia, powinny podlegać silniejszym siłom ewolucyjnym.

Różne systemy krycia generują zróżnicowanie w poziomach postkopulacyjnej presji selekcji seksualnej, a zatem zmienność morfologiczną; na przykład, gatunki o wysokim poziomie konkurencji plemników mają tendencję do posiadania dużych jąder w stosunku do ich masy ciała. Pozostała masa jąder jest zatem uważana za wiarygodną miarę systemu kojarzenia populacji, a tym samym stopnia presji selekcji seksualnej. Orr & Brennan stwierdził, że względna masa jąder była znaczącym predyktorem obecności baculum u Chiroptera, Eulipotyphla, Primates i Rodentia. Jednakże w tym samym badaniu nie stwierdzono związku między obecnością lub szerokością baculum a systemem krycia, co wskazuje, że w grę może wchodzić jeszcze trzecia zmienna. Ramm sprawdził zależność między masą jąder a długością woreczka u czterech rzędów, ustalając najpierw poziom zależności filogenetycznej między gatunkami, a następnie przeprowadzając odpowiednio skorygowane regresje. Pozytywny związek między masą jąder a długością woreczka odnotowano u Rodentia i Carnivora, ale ten sam test nie wykazał żadnego związku u Primates czy Chiroptera.

Adaptacyjna funkcja woreczka, przy wysokim poziomie selekcji wewnątrz płciowej, nie została jeszcze ustalona. Potencjalną strategią, dzięki której samiec może zwiększyć swój sukces reprodukcyjny, konkurując z rywalizującymi samcami, jest przedłużenie intromisji, a w konsekwencji opóźnienie krycia samicy przez innego samca. Hipoteza przedłużonej intromisji argumentuje, że baculum pomaga ułatwić ten przedłużony czas trwania intromisji poprzez wspieranie penisa .

W tym kontekście, przybliżony mechanizm baculum jest działać jako pręt wspierający, wzmacniając penisa i chroniąc cewkę moczową podczas przedłużonej intromisji . Ostatnie badania przeprowadzone na trzech różnych gatunkach nietoperzy wykazały, że baculum tworzy funkcjonalną jednostkę z ciałami jamistymi, które chronią wierzchołek żołędzi i trzon penisa podczas erekcji. Autorzy uważają, że baculum pomaga również ograniczyć zwężenie dystalnej cewki moczowej i otworu cewki moczowej we wzwiedzionym penisie podczas intromisji, ułatwiając przepływ spermy. U wielu gatunków naczelnych, u których baculum jest wydłużone, dystalny koniec kości wystaje nieco z cewki moczowej, podczas gdy penis jest w stanie wzwodu. To może przynieść baculum do kontaktu z szyjki macicy kobiety podczas intromisji, ułatwiając transfer nasienia do kanału szyjki macicy .

Dowody dla hipotezy przedłużonej intromisji do tej pory okazały się kontrowersyjne. Wczesne badania wykazały, że przedłużona intromisja była skorelowana z wydłużonymi bekulami u naczelnych i mięsożerców; badania te nie uwzględniały jednak statystycznej nie-niezależności danych, która wynika ze wspólnej historii ewolucyjnej między gatunkami. W późniejszych badaniach, skorygowanych w celu uwzględnienia filogenezy, sprawdzono korelację między przedłużoną intromisją a długością baculum u północnoamerykańskich mięsożerców, ale nie znaleziono poparcia dla tej hipotezy. Jednak dane do przetestowania tej hipotezy były dostępne tylko dla 18 gatunków, z których tylko dwa charakteryzowały się krótkim czasem trwania intromisji. Dixson i wsp. twierdzą, że ta próba nie jest wystarczająco reprezentatywna, aby zdecydowanie obalić hipotezę przedłużonej intromisji, i przeprowadzili własną, skorygowaną filogenetycznie analizę na próbie 57 gatunków ssaków. Tym razem stwierdzono znaczącą korelację między tymi dwiema zmiennymi. Chociaż oba badania zostały skorygowane pod kątem filogenezy, jeśli stopień zależności filogenetycznej nie jest ustalony przed skorygowaniem analizy, korekta filogenezy może dać mylące lub błędne wyniki, ponieważ poziom pokrewieństwa między gatunkami różni się w obrębie filogenezy. Bayesian Markov chain Monte Carlo (MCMC) analizy umożliwiają filogenezy gatunków być włączone do analizy, a nie tylko korygowanie dla filogenezy, a tym samym może produkować bardziej wiarygodne wyniki .

W nowym badaniu, Schultz et al. używane wcześniejsze metody filogenetyczne mapowania stochastycznego do modelowania obecności i braku baculum w 954 gatunków ssaków, i twierdzą, że baculum niezależnie ewoluował co najmniej dziewięć razy w ssaków. Jest jednak mało prawdopodobne, by ta próbka odzwierciedlała przebieg ewolucji w całej klasie ssaków, zwłaszcza że brak wędzidełka odnotowano tylko u 103 gatunków.

Tutaj wykorzystujemy filogenetyczne metody porównawcze w ramach Bayesian MCMC, by zbadać historię ewolucji wędzidełka i zbadać hipotezę, że zwiększone poziomy selekcji wewnątrzseksualnej wpływają na ewolucję wędzidełka. Najpierw zrekonstruowaliśmy trajektorię ewolucyjną baculum w całej klasie ssaków i zbadaliśmy tempo ewolucji baculum w rzędu naczelnych. Następnie sprawdziliśmy, czy istnieje związek między długością baculum a masą jąder u naczelnych i mięsożerców. Następnie sprawdziliśmy, czy obecność baculum jest skorelowana z czasem trwania intromisji u naczelnych, po czym przeprowadziliśmy filogenetyczne testy t w celu ustalenia, czy naczelne i mięsożerne o dłuższym czasie trwania intromisji mają dłuższe bacula niż te o krótkim czasie trwania intromisji. Wreszcie, użyliśmy tych samych testów do zbadania, czy zwiększony poziom postkopulacyjnej presji selekcji seksualnej spowodowanej (i) poligamicznymi systemami kojarzenia i (ii) sezonowymi wzorcami rozrodu doprowadził do zwiększenia długości baculum u naczelnych. Naczelne i drapieżniki są szczególnie interesującymi grupami do badań, ponieważ w obrębie każdego rzędu występuje mieszanina obecności i braku baculum. Oznacza to, że różnice między osobnikami posiadającymi i nieposiadającymi baculum można śledzić na poziomie gatunkowym, a nie między rzędami. Ponadto, ponieważ te rzędy są prawdopodobnie szerzej badane niż inne grupy ssaków, dostępnych jest więcej danych.

Jeśli baculum ułatwia przedłużoną intromisję i zwiększoną bliskość szyjki macicy w celu zmniejszenia poziomu konkurencji plemników i zwiększenia sukcesu reprodukcyjnego, to można dokonać i przetestować kilka przewidywań. Oczekiwano by, że będzie istniał związek między długością baculum a masą jąder, co może być wykorzystane jako wskaźnik poziomu postkopulacyjnej presji selekcji płciowej w populacji. Oczekuje się, że czas trwania intromisji będzie korelował z obecnością baculum w toku ewolucji. Gatunki o dłuższym czasie trwania intromisji powinny mieć wydłużone baculum. Wreszcie, grupy, w których postkopulacyjna presja selekcji seksualnej jest najwyższa, takie jak te, w których krycie jest poligamiczne lub zachodzi sezonowo, powinny mieć dłuższe bekuly niż grupy o niższym poziomie postkopulacyjnej presji selekcji seksualnej.

Materiał i metody

Rekonstrukcje stanu przodków, testy skorelowanej ewolucji, testy zależności cech i filogenetyczne testy t przeprowadzono przy użyciu BayesTraits (v. 2). Dane dotyczące cech zostały zebrane z literatury (elektroniczny materiał uzupełniający).

Fylogeneza supertree 5020 wymarłych ssaków została wykorzystana do rekonstrukcji stanów ancestralnych obecności baculum w całym porządku ssaków. Wszystkie analizy rzędu naczelnych i drapieżników przeprowadzono na rozkładach posterior 10 000 filogenez molekularnych wnioskowanych metodami Bayesian MCMC. Chronogramy były używane we wszystkich rekonstrukcjach stanów przodków i testach skorelowanej ewolucji, podczas gdy filogramy były używane w testach zależności cech i filogenetycznych testach t.

A reversible-jump MCMC method with an exponential hyperprior ranging between 0 and 0.07 was used to estimate discrete ancestral states . Każdy łańcuch był prowadzony przez 5 milionów iteracji z wypaleniem 50 000 iteracji; tak było w przypadku wszystkich analiz poza modelem o zmiennym tempie. Interesowało nas wnioskowanie o siedmiu kluczowych węzłach w filogenezie ssaków, a także o stanie ancestralnym obecności baculum zarówno dla rzędu naczelnych, jak i drapieżników (elektroniczny materiał uzupełniający, ryc. S1). Węzły zostały skonstruowane przy użyciu procedury 'add MRCA’ w BayesTraits .

Model o zmiennym tempie został użyty do rekonstrukcji przebiegu ewolucji długości baculum w obrębie rzędu naczelnych (za Venditti i in. ). Model ten pozwala na zmianę tempa ewolucji w filogenezie w czasie, identyfikując, kiedy i gdzie tempo ewolucji różniło się bez wcześniejszej wiedzy. Rozciągnięte gałęzie drzewa filogenetycznego wskazują, że dana cecha ewoluowała szybko, a ściśnięte gałęzie wskazują na wolne tempo zmian cechy. Model był uruchamiany przez 10 milionów iteracji, z okresem wygrzewania 100 000 iteracji.

Długość baculum i masa jąder były testowane pod kątem związku przy użyciu regresji wielokrotnej pomiędzy długością baculum, masą jąder i masą ciała dorosłego samca. Model był uruchamiany trzykrotnie i wybierano łańcuch z medianą log marginalnego prawdopodobieństwa; takie podejście stosowano również przy przeprowadzaniu ewolucji skorelowanej i testach hipotez. Proporcja parametru nachylenia (β), która przecięła zero została użyta do ustalenia wartości p (zgodnie z metodą Organ et al. dla filogenetycznych testów t).

Aby sprawdzić skorelowaną ewolucję między obecnością baculum a czasem trwania intromisji, porównano log marginalnych prawdopodobieństw modeli niezależnych (cechy zmuszone do oddzielnej ewolucji) i zależnych. Zastosowano hiperpriorytet wykładniczy z zakresem 0-0,05. Dwa modele zostały porównane przy użyciu log naturalnych współczynników Bayesa (BF), obliczonych jako dwukrotna różnica w log marginalnych prawdopodobieństwach między modelami. BF były interpretowane zgodnie z Kass et al.: 0-2, minimalne wsparcie; 2-6, pozytywne wsparcie; 6-10, silne wsparcie; więcej niż 10, bardzo silne wsparcie. W najnowszej literaturze zwrócono uwagę na kilka problemów związanych z wykorzystaniem średniej harmonicznej jako miary do szacowania logarytmicznego prawdopodobieństwa krańcowego modelu oraz na względne zalety metody próbkowania kroczącego, która jest uważana za dokładniejszą. Dlatego też zastosowaliśmy metodę próbkowania kroczącego do oszacowania logarytmicznego prawdopodobieństwa krańcowego. Sto kamieni zostało użytych na 10 000 iteracji łańcucha Markowa. Za Xie et al. zastosowano rozkład beta (α, 1.0), a α ustalono na 0.3. Stepping-stones zostały użyte w ten sposób dla wszystkich testów zależności cech, skorelowanej ewolucji i filogenetycznych t-testów.

Filogenetyczne t-testyMCMC zostały użyte do testowania hipotez uwzględniających statystyczną nie-niezależność danych, wynikającą ze wspólnej historii ewolucyjnej (za Organ i in. ).

Wyniki

Analiza wielostanowa w BayesTraits (n = 1818) wskazuje, że przodek ssaka nie posiadał baculum (baculum absence, średnie prawdopodobieństwo = 0,98). Rekonstrukcje stanu ancestralnego w sześciu węzłach (tabela 1; elektroniczny materiał uzupełniający, rycina S1) sugerują, że baculum wyewoluowało po raz pierwszy po rozdzieleniu ssaków niepłciowych i łożyskowych (brak baculum, średnie prawdopodobieństwo = 0,93), ale przed wyewoluowaniem najnowszego wspólnego przodka (MRCA) naczelnych i mięsożernych (obecność baculum, średnie prawdopodobieństwo = 0,99). Zarówno przodek naczelnych, jak i mięsożerców miał baculum (obecność baculum, średnie prawdopodobieństwo = odpowiednio 1,00 i 1,00).

Trajektorię ewolucyjną długości baculum zwizualizowano za pomocą modelu variable-rates, który rozciąga lub kurczy gałęzie drzewa filogenetycznego zgodnie z różnym tempem ewolucji cechy (ryc. 1; elektroniczny materiał uzupełniający, ryc. S2-S4). U naczelnych występuje wyraźne zróżnicowanie długości baculum, co znajduje odzwierciedlenie w ich historii ewolucyjnej. Bardzo niewielkie zmiany zaszły u platyrkinów i tarsierów, które mają małe lub nieobecne baculum, co wskazuje, że baculum przodków naczelnych było dość małe. Natomiast strepsirrhines i catarrhines przeszły stosunkowo szybkie zmiany ewolucyjne i mają dłuższe bacula niż platyrrhines i tarsiers. Małpy człekokształtne stanowią interesującą grupę, gdyż przeszły one wysokie tempo zmian, a mimo to mają bardzo małe lub nieobecne bekuly. Sugeruje to, że po rozdzieleniu się linii platyrrynów i katarryn, baculum przodka katarrynów przeszło szybką ewolucję i stało się znacznie dłuższe. Gdy następnie małpy oddzieliły się od małp Starego Świata, trend ten odwrócił się i baculum małp przeszło dalsze wysokie tempo ewolucji, tym razem redukując swoją długość. (Zob. elektroniczne materiały uzupełniające do drzew o zmiennym tempie, przedstawiających ewolucję długości baculum u mięsożerców oraz ewolucję masy jąder u naczelnych i mięsożerców, ryc. S2-S4.)

Długości baculum nie można było przewidzieć na podstawie masy jąder ani u naczelnych (n = 46, p = 0,139, R2 = 0.03) lub mięsożerców (n= 32, p= 0,231, R2= 0,37) (elektroniczny materiał uzupełniający, tabela S2).

Znaleźliśmy pozytywne dowody na skorelowaną ewolucję między obecnością baculum a czasem trwania intromisji u naczelnych (n = 299, log BF = 4,78; tabela 2). Rekonstrukcje stanu ancestralnego i wskaźniki modelowe wskazują, że obecność baculum i krótki czas trwania intromisji (średnie prawdopodobieństwo = 0,73) poprzedziły przejście do przedłużonej intromisji (ryc. 2). Po wykształceniu się długiego czasu trwania intromisji, baculum było rzadko tracone. Natomiast w przypadku, gdy czas trwania intromisji pozostawał krótki, baculum było często tracone. Długie okresy intromisji rzadko stawały się ponownie krótkie, gdy obecne było baculum. Dla kontrastu, gdy baculum było nieobecne, czas trwania intromisji często zmieniał się z długiego na krótki.

Hipoteza, że postkopulacyjna selekcja płciowa wpływa na długość baculum została przetestowana poprzez serię filogenetycznych testów t (tabela 3). Zgodnie z naszymi przewidywaniami stwierdziliśmy, że gatunki zarówno z rzędu naczelnych, jak i mięsożernych, u których intromisja jest przedłużona, mają istotnie dłuższe baculum niż gatunki, u których intromisja jest krótka (odpowiednio n = 53, p = 0,000 i n = 41, p = 0,018). U naczelnych o poligamicznych systemach kojarzenia stwierdzono istotnie dłuższe bekuly niż u tych o innych systemach kojarzenia (n = 65, p = 0,032). Wreszcie, ssaki naczelne rozmnażające się sezonowo mają istotnie dłuższe bacula niż ssaki naczelne, które nie rozmnażają się sezonowo (n = 63, p = 0,045).

Dyskusja

Nasze wyniki odsłoniły trajektorię ewolucyjną baculum w całej klasie ssaków, Pokazujemy, że wędzidełko po raz pierwszy wyewoluowało po podziale ssaków łożyskowych i niepłaskonosych około 145 milionów lat temu (Ma), ale przed wyewoluowaniem MRCA naczelnych i mięsożernych około 95 Ma . Po raz pierwszy wykazujemy, że zarówno przodek naczelnych, jak i przodek mięsożerców posiadał baculum, co ma istotne implikacje dla sposobu, w jaki baculum powinno być badane w obrębie tych rzędów. Analizy powinny skupić się na zbadaniu, dlaczego baculum zostało zachowane u niektórych gatunków i utracone u innych, a nie dlaczego baculum mogło ewoluować; było już obecne u ich przodków.

Nie znaleźliśmy związku między długością baculum a masą jąder u naczelnych lub mięsożerców, popierając wcześniejsze ustalenia u naczelnych, ale nie u mięsożerców. Ta rozbieżność jest prawdopodobnie wyjaśniona przez zastosowanie bayesowskich ram filogenetycznych do naszych analiz; nasze odkrycie sugeruje, że jakikolwiek zaobserwowany związek między długością baculum a masą jąder mógł wyewoluować przypadkowo. Choć wyniki te nie potwierdzają hipotezy, że długość baculum jest selekcjonowana płciowo, nie obalają jej. Jest możliwe, że aspekty morfologii wędzidełka, takie jak jego szerokość czy kształt, są bardziej prawdopodobne, że będą się zmieniać wraz z masą jąder. Na przykład, szerokość wału baculum jest znaczącym predyktorem liczby potomstwa wydanego przez samce myszy domowych. Rzeczywiście, Orr & Brennan stwierdził, że masa jąder przewidywała szerokość baculum w czterech rzędach ssaków; jednak, gdy związek ten został przetestowany przy użyciu modelu filogenetycznego, szerokość baculum nie była już znaczącym predyktorem. Możliwe, że wyniki te pozostałyby znaczące, gdyby związek ten był badany na poziomie rzędu, jako że funkcja baculum może się różnić w zależności od rzędu. Nasze wyniki służą podkreśleniu znaczenia stosowania pełnych metod filogenetycznych przy badaniu ewolucji cech.

Badanie to jako pierwsze wykazało, że obecność baculum korelowała z czasem trwania intromisji w toku ewolucji naczelnych. Wynik ten podkreśla wzajemną zależność między fenotypami morfologicznymi i behawioralnymi w czasie ewolucji. Baculum fizycznie wspiera i chroni penisa samca oraz pomaga w przenoszeniu nasienia w kierunku szyjki macicy samicy. Jednakże, odgrywa również ważną rolę w ułatwianiu przedłużonej intromisji, która sama w sobie może być wybranym płciowo zachowaniem, mającym na celu zwiększenie sukcesu reprodukcyjnego poprzez opóźnianie samic z ponownego krycia .

Nasze wyniki potwierdzają, że hipoteza przedłużonej intromisji pozostaje solidna, gdy jest analizowana w rygorystycznych ramach filogenetycznych. Filogenetyczne t-testy pokazują, że baculum jest znacznie dłuższe zarówno u naczelnych, jak i u drapieżników, u których intromisja jest przedłużona. Sugeruje to, że wydłużenie baculum w toku ewolucji ssaków było prawdopodobnie podyktowane jego użytecznością w przedłużonej intromisji. Dwa kolejne filogenetyczne t-testy wykazały, że naczelne w poligamicznych systemach krycia i naczelne rozmnażające się sezonowo miały znacznie dłuższe bekuly niż naczelne w innych systemach krycia i te bez sezonowego wzorca rozrodu, co podkreśla znaczenie postkopulacyjnej selekcji płciowej jako czynnika napędzającego ewolucję bekularyzacji.

Wyniki testu skorelowanej ewolucji, w połączeniu z wynikami filogenetycznych t-testów, pozwalają nam zacząć układać razem bliższe i dalsze funkcje bekularyzacji. Poligamiczne systemy kojarzenia i ograniczone sezony rozrodcze powodują wysoki poziom postkopulacyjnej konkurencji seksualnej. W tym środowisku przedłużenie intromisji może opóźnić ponowne krycie samicy, zwiększając tym samym szansę samca na skuteczne zapłodnienie w warunkach konkurencji. Zapewnienie drożności cewki moczowej i jak najmniejszego dystansu do pokonania przez plemniki jest sposobem na zwiększenie ilości plemników transportowanych do kanału szyjki macicy. Baculum służy jako struktura podtrzymująca podczas przedłużającej się intromisji, zarówno chroniąc cewkę moczową, jak i zapobiegając jej zwężeniu .

Wyniki te niekoniecznie odnoszą się do innych rzędów w obrębie klasy ssaków, ale podkreślają potencjalnie satysfakcjonujące kierunki badań. Należy również zauważyć, że nawet w obrębie rzędu naczelnych i mięsożernych inne czynniki mogą wpływać na to, czy baculum jest zachowane, czy nie i jak rozwija się jego morfologia. Badania nad ewolucją baculum koncentrują się na tym, dlaczego jest ono obecne u niektórych gatunków, lub dlaczego jego długość lub szerokość mogła wzrosnąć; czynniki powodujące redukcję lub zanik baculum zostały w dużej mierze zignorowane.

Wspaniałe badania zaczynają rozróżniać przybliżony mechanizm baculum, jak również niektóre z czynników powodujących jego ewolucję w różnych rzędach ssaków. Porównując te wyniki w różnych rzędach i badając baculum w ramach filogenetycznych, możemy zacząć budować bardziej wszechstronny obraz przybliżonych i ostatecznych funkcji baculum oraz tego, jak ewoluowało ono u istniejących gatunków i ich przodków.

Dostępność danych

Dane są dostępne z Dryad Digital Repository .

Wkład autorów

M.B. i C.O. zaprojektowali badania; M.B. i C.O. wykonali badania; M.B. i C.O. przeanalizowali dane; M.B. i C.O. przygotowali manuskrypt. All authors gave final approval for publication.

Competing interests

We have no competing interests.

Funding

M.B. is supported by a NERC Doctoral Training Studentship, and C.O. is supported by a Leverhulme Early Career Fellowship.

Footnotes

Electronic supplementary material is available online at http://dx.doi.org/10.6084/m9.figshare.c.3583481.

.