Results and Discussion
VARV Genome Stability and Phylogenetic Analysis.
Dostępność sekwencji genomowych ze zbioru izolatów VARV o szerokiej dystrybucji geograficznej (ryc. 1) została wykorzystana do badań ewolucyjnych VARV (4). VARV, członek rodzaju Orthopoxvirus, zawiera pojedynczy liniowy dwuniciowy genom DNA o długości 186 kb, który koduje większość enzymów potrzebnych do jego rozmnażania (5). Badane izolaty VARV wykazywały niski wskaźnik mutacji, ponieważ epidemiologicznie powiązane izolaty wykazywały niewielkie zmiany w sekwencji lub nie wykazywały ich wcale w próbkach pobranych w odstępie do 1 roku. Ten niski wskaźnik mutacji może być wyraźnie widoczny w naszych genetycznie identycznych próbkach z Bangladeszu zebranych w latach 1974 i 1975. Próbki te z pewnością reprezentują długie złożone łańcuchy transmisji z jednego z najgęściej zaludnionych regionów na świecie, ale mają identyczne lub prawie identyczne sekwencje nukleotydów. Pokrewny wirus ospy małp Orthopoxvirus podobnie wykazuje pojedyncze zmiany nukleotydów lub ich brak wśród izolatów pochodzących od trzech różnych gospodarzy w niedawnym wybuchu epidemii w Stanach Zjednoczonych (6). W obrębie gatunków ortopoksowirusów i pomiędzy nimi, genomy posiadają identyczność nukleotydów >99,6% wśród izolatów VARV i 98% wśród VARV i taksonów pokrewnych, takich jak wirus taterapox (TATV) (4) (Afryka Zachodnia) i wirus ospy wielbłądziej (CMLV) (7) (Azja Środkowa) (Tabela 1), dwa gatunki o najwyższym podobieństwie sekwencji do VARV (4). Duży rozmiar i wolne tempo substytucji nukleotydów pozwalają genomowemu DNA VARV na zachowanie mutacji filogenetycznie informatywnych przy jednoczesnym obniżeniu częstości występowania mutacji homoplastycznych (tj. mniejsza liczba odwróceń stanów znaków). Różnorodność 47 ostatnio zsekwencjonowanych genomów VARV była w dużej mierze związana z pochodzeniem geograficznym izolatów (ref. 4 i niniejsze badanie), a mutacje miały minimalny związek z czasową zmiennością między izolatami. Te obserwacje pokazują, że nie było jednego szczepu pandemicznego ( SI Text , Uwaga 1), ale raczej, że klady genetyczne tych analiz są reprezentatywne dla starych i być może starożytnych lokalnie endemicznych szczepów.
Hipotezy pochodzenia VARV. Zdarzenie 0, Wysokie podobieństwo VARV do sekwencji genomu CMLV i TATV sugeruje, że TATV i CMLV mają nowszego wspólnego przodka z VARV niż inne znane gatunki Orthopoxvirusów. Wydarzenie 1, hipoteza A: Przodek VARV podzielił się na dwa pierwotne klady (P-I i P-II) i ewoluował niezależnie w Starym i Nowym Świecie podążając za swoimi ludzkimi gospodarzami. Zdarzenie 1, hipoteza B: Dywergencja P-I/P-II w Afryce. Zdarzenie 2, hipotezy A i B: Długa pojedyncza gałąź i późniejsza radiacja P-I sugerują, że przodek VARV P-I prawdopodobnie pochodzi z północno-wschodniej Azji i że endemity ospy wietrznej P-I zaczęły rozprzestrzeniać się do wschodniej Azji, Bliskiego Wschodu i Indii, gdy lokalne populacje stały się wystarczająco duże. Wydarzenie 2a, Zróżnicowanie i migracja P-I w całej Azji. Wydarzenie 2b, eksploracja Zachodu przyniosła VARV major do Afryki Południowej z subkontynentu indyjskiego, który następnie rozprzestrzenił się na północ do Afryki Środkowej i Rogu Afryki (Półwysep Somalijski). Wydarzenia 3 i 4, hipoteza A: Zróżnicowanie P-II w Nowym Świecie, po którym nastąpiła jego reintrodukcja do Afryki; hipoteza B: Dywersyfikacja P-II w Afryce, a następnie późniejsze wprowadzenie jednej podklady do Nowego Świata.
Jeśli promieniowanie P-I reprezentuje historię endemiczności ospy w Starym Świecie, wyjaśnia to historyczną zagadkę dotyczącą braku opisu ospy w literaturze starożytnych cywilizacji greckiej i rzymskiej (1). Prawdopodobnie epidemie ospy w tym regionie wystąpiły w okresie późniejszym niż te w starożytnych Chinach i Indiach. Opisana przez Thucydidesa „zaraza ateńska” w 430 r. p.n.e., uważana niegdyś za ospę (3), zaprzeczałaby tej teorii, ale ostatnio stwierdzono, że była to tyfus brzuszny (25). Podczas panowania Ramzesa V, Egipt był w stanie wojny domowej i był atakowany przez wrogów z północy (3); jeśli krostowata erupcja Ramzesa V pochodziła od ospy, mogła reprezentować epidemię ospy z importowanych przypadków z powodu wojny, a nie regionalną chorobę endemiczną. Hipoteza ta jest wspierana przez fakt, że tylko trzy mumie w tym okresie miały podobne zmiany (2).
Dywersyfikacja Alastrim minor.
Analizy oparte na topologii historii ospy/VARV pokazują, że dywergencja alastrim minor i zachodnioafrykańskiej varioli rozpoczęła się co najmniej 800 lat temu (Tabela 2 i SI Tabela 4), wyprzedzając poprzednią hipotezę, że ta dywergencja zbiega się z początkiem handlu niewolnikami. Zgodnie z bardziej starożytną hipotezą pochodzenia, ta dywergencja mogła nastąpić po wydarzeniu specjacji w Nowym Świecie (w oparciu o kalibrację z najwcześniejszych historycznych zapisów ospy; ryc. 3 A) lub Afryce Zachodniej (w oparciu o kalibrację z południowoafrykańskich historycznych zapisów ospy; ryc. 3 B). Te scenariusze sugerowałyby, że istniały niezidentyfikowane izolaty variola minor/alastrim, które istniały w Afryce lub Nowym Świecie znacznie wcześniej niż odkrycie alastrim minor (P-II); zatem ten takson ma dłuższą historię niż została opisana.
Choć dobrze udokumentowane import VARV major do obu Ameryk miał niszczycielski wpływ na wielu rodzimych populacji (2), zapisy szybkiego rozprzestrzeniania się choroby z dużą śmiertelnością może, w części, być przypisane do połączonego efektu wysokiej gęstości zaludnienia, brak podstawowej opieki dla ofiar i potencjalnych koinfekcji z innymi chorobami Starego Świata (26, 27). Historycznie, istnieje niewiele zapisów ospy w Afryce Zachodniej, a Henige (28) twierdził, że pierwszy VARV poważne ognisko ospy w Nowym Świecie nie pochodzi z Afryki Zachodniej, co obaliłoby hipotezę o wczesnej historii ospy w Afryce Zachodniej. Jest możliwe, że po starożytnym wprowadzeniu, alastrim ewoluował niezależnie w izolowanych regionach w obrębie dużego obszaru geograficznego Nowego Świata. W rzeczywistości, badanie Phelana wykazało, że rodzime populacje na Wyżynie Ekwadorskiej nie zmniejszyły się podczas początkowego hiszpańskiego panowania (przypisuje się, że wprowadził VARV major do Nowego Świata) (29), sugerując, że te populacje mogły być bardziej odporne na ospę, być może przez wcześniejszy kontakt z alastrim. W Trynidadzie, udokumentowano, że łagodny wybuch ospy w 1902 roku pochodził z tego regionu (30). Jeśli ta dywersyfikacja miała miejsce w Nowym Świecie, to pierwotne zdarzenie izolacyjne prawdopodobnie wynikałoby z przemieszczenia się przodka VARV z wczesnymi ludźmi do tego regionu (ryc. 4A). Brak SNP sygnatury sugerujące mieszanie między P-I i P-II (SI Figs. 6 i 7), spójne i znacząco różne właściwości kliniczne alastrim z tradycyjnych VARV major P-I (31), można wyjaśnić przez takie znaczące geograficznej separacji.
Jeśli podział P-I/P-II wystąpił w obrębie Starego Świata, P-II prawdopodobnie pochodzi w Afryce Zachodniej. Dwa podklady P-II rozeszłyby się ≈800-1,100 YBP (Tabela 2 i SI Tabela 4) na kontynencie afrykańskim. Geograficzne rozmieszczenie tych wydarzeń jest trudne do określenia z powodu braku historii pisanej w tych regionach. Jednakże obecność i różnicowanie się innych blisko spokrewnionych ortopoksowirusów, takich jak ospa małpia i TATV, może przemawiać za afrykańskim pochodzeniem przodków VARV. Jeśli izolacja i dywersyfikacja P-II miała miejsce w Afryce, to na podstawie naszej filogenezy istnieje nieopisany afrykański przedstawiciel podklady P-II, który został wprowadzony do Nowego Świata być może setki lat po wydarzeniu dywersyfikacji, prawdopodobnie w czasie handlu niewolnikami między krajami Starego i Nowego Świata (ryc. 3 B). 3 B).
Nieodpowiednie zrozumienie historii tych kultur i stosunkowo łagodniejsze objawy kliniczne (w odniesieniu do variola major) przyczyniają się do braku szerszego historycznego zapisu choroby (chorób) ospy prawdziwej w Nowym Świecie lub Afryce Subsaharyjskiej. Historyczne gęstości populacji ludzkiej w obu tych regionach były niższe niż w regionach z endemiczną variola major. W przypadkach łagodniejszej choroby, jednostki byłyby bardziej mobilne, gdy były zakaźne i miałyby większą liczbę kontaktów, a tym samym utrwalałyby rozprzestrzenianie się choroby. Na poparcie tej hipotezy, łagodne ogniska ospy w Somalii utrzymywały się przez długie okresy wśród małych grup koczowniczych i wykazywały znacząco odmienny wzór przenoszenia w porównaniu z VARV major (2). Chociaż nie wiadomo, czy praktyka wariolacji/zaszczepiania była stosowana przez rdzenną ludność Afryki lub obu Ameryk, długa żywotność VARV w strupach rekonwalescentów (do dekady) (32-34) zapewniłaby kolejny mechanizm wielokrotnego wprowadzania szczepu ospy w obrębie społeczności geograficznej albo przez niezamierzony kontakt z materiałami strupów lub bezpośrednio przez praktyki wariolacji.
Pochodzenie VARV.
Możliwe wskazówki dotyczące adaptacji VARV do ludzi można znaleźć w bliskim związku pomiędzy VARV i TATV/CMLV (4). TATV jest związany z gryzoniem lądowym pochodzącym z Afryki Zachodniej (35). Nasze analizy koalescencyjne wskazują, że dywergencja między VARV i TATV nastąpiła od 16,000 YBP (Tabela 2 i SI Dataset 4, w oparciu o historyczne zapisy ospy w Afryce Południowej) do 68,000 YBP (Tabela 2 i SI Dataset 3, w oparciu o najwcześniejsze zapisy historii ospy w Azji Wschodniej). Tak więc, podobnie jak pokrewne zoonotyczne ortopoksowirusy z rezerwuarami gryzoni (6, 36, 37), VARV mógł wyewoluować z enzootycznego patogenu gryzoni afrykańskich, a następnie rozprzestrzenić się poza Afrykę.
Sekwencje genomowe izolatów VARV wybranych do tego badania zostały pobrane z repozytorium World Health Organization Collaborating Center i chociaż wykazują niski poziom dywergencji sekwencji, są reprezentatywne dla największej różnorodności geograficznej i czasowej w kolekcji. Filogeneza tych izolatów oparta na cSNP tworzy topologię zgodną z historycznymi wzorcami migracji ludzi, ekspansją populacji i udokumentowanymi epidemiami ospy prawdziwej. Przedstawiona topologia wspiera hipotezę (Ryc. 3), że dwa klady variola oddzieliły się od wirusa przodka, a następnie ewoluowały w geograficznie odrębnych populacjach ludzkich. Chociaż przyczyna różnej patogenności u ludzi alastrimu i VARV major jest niejasna, struktura genetyczna alastrimu minor i jego topologia z innymi izolatami VARV dodają krytyczne elementy do ewolucyjnej układanki ospy wietrznej. Ta proponowana filogeneza VARV wydłuża czas ewolucji ospy prawdziwej w stosunku do poprzednich teorii.