Dose and Time Effects of Caffeine Intake on Human Platelet Adenosine A2A Receptors

Kofeina, występująca w różnych źródłach, takich jak kawa, herbata, czekolada i napoje typu cola, jest najbardziej rozpowszechnioną substancją czynną na świecie. Średnie spożycie kofeiny przez dorosłych ludzi waha się w różnych kulturach i narodach od 80 do 400 mg na osobę dziennie.1 Kofeina wywołuje różnorodne reakcje farmakologiczne, w tym wzmożoną czujność, skrócenie czasu reakcji psychomotorycznej oraz wydłużenie czasu snu i czuwania, a także może wpływać na sprawność intelektualną.2 Ponadto kofeina powoduje relaksację mięśni gładkich, zwiększa wydzielanie kwasu żołądkowego i uwalnianie amin katecholowych oraz zwiększa aktywność metaboliczną.3

Dokładny mechanizm(y) leżący u podstaw działania kofeiny pozostaje słabo zdefiniowany. Chociaż hamowanie fosfodiesterazy może przyczyniać się do działania kofeiny,4 istnieje coraz więcej dowodów na to, że większość efektów farmakologicznych tej ksantyny wynika z antagonizmu receptorów adenozynowych oznaczonych jako podtypy A1, A2A, A2B i A3.5 Kofeina działa najsilniej na receptory A2A, następnie na receptory A1, potem A2B,6 i jako słaby antagonista na ludzkie receptory A3. Blokowanie przez kofeinę receptorów adenozyny, a mianowicie typów receptorów A1 i A2A, hamuje działanie endogennej adenozyny na różne procesy fizjologiczne.7 W normalnych warunkach stężenie adenozyny we krwi wydaje się wystarczające do tonicznej aktywacji receptorów A2A w płytkach krwi. Ostatnio u myszy pozbawionych receptorów A2A stwierdzono zwiększoną agregację płytek krwi, co wskazuje na znaczenie tego podtypu receptora w funkcjonowaniu płytek krwi.8 Można zatem przypuszczać, że kofeina może blokować te aktywowane tonicznie receptory A2A w płytkach krwi i zmieniać ich funkcje modulowane przez adenozynę.

Przez wiele lat podejrzewano związek między piciem kawy a chorobami układu sercowo-naczyniowego, w szczególności chorobą wieńcową serca,9 ale ostatnio wykazano, że spożywanie kawy lub kofeiny nie zwiększa ryzyka chorób wieńcowych serca ani udaru mózgu.1011 W licznych badaniach epidemiologicznych uwzględniających zawał serca nie stwierdzono szkodliwego wpływu <5 filiżanek kawy dziennie, natomiast wyniki są kontrowersyjne przy wyższych poziomach spożycia.12 U pacjentów z nadciśnieniem tętniczym nie zaobserwowano niekorzystnego ryzyka przy jakimkolwiek poziomie spożycia kofeiny.13

W badaniu przeprowadzonym przez Biaggioni i wsp.14 stwierdzono, że powtarzany schemat dawkowania kofeiny prowadzi do istotnych zmian w ludzkich płytkach krwi w zakresie odpowiedzi czynnościowej na agonistę receptora adenozyny 5′-N-etylo-karboksyamidoadenozynę (NECA). Odstawienie kofeiny spowodowało znaczące przesunięcie w lewo hamowania agregacji wywołanego przez NECA.14 W związku z tym niedawno wykazaliśmy,15 u osób leczonych kofeiną w dawce 750 mg/d przez 1 tydzień, że przewlekłe przyjmowanie kofeiny zmienia agregowalność płytek krwi w wyniku upregulacji receptorów A2A znajdujących się na powierzchni płytek.

W niniejszym artykule przedstawiamy dalsze dowody na to, że podobna odpowiedź występuje u osób leczonych kofeiną w różnych dawkach, takich jak 600 mg/d przez 1 tydzień lub 400 mg/d, podawanych przez dłuższy czas, np. 2 tygodnie. W obecnym badaniu dokonano tego poprzez bezpośredni pomiar zmian w receptorach adenozynowych A2A (gęstość i powinowactwo) oraz ich funkcji, określając wpływ selektywnego agonisty A2A 2-heksynylo-NECA (HE-NECA) na (1) zwiększenie akumulacji cAMP, (2) hamowanie agregacji płytek krwi oraz (3) obniżenie poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego. Po przewlekłym spożyciu (600 mg/d przez 1 tydzień lub 400 mg/d przez 2 tygodnie) stwierdzono wzrost regulacji płytkowych receptorów adenozynowych A2A, co było silnie skorelowane z działaniem antyagregacyjnym, wzrostem akumulacji cAMP i spadkiem poziomu wapnia wewnątrzkomórkowego. Nie wykazano różnic w zakresie parametrów wiążących i czynnościowych u osób leczonych dawką 400 mg/d przez 1 tydzień.

Metody

Badano 45 zdrowych, niepalących osób, w wieku od 25 do 45 lat, obojga płci. Po wyrażeniu pisemnej świadomej zgody, badani zostali poproszeni o powstrzymanie się od spożywania metyloksantyn przez ≥2 tygodnie. Podzielono ich na 3 grupy (po 15 osób) w zależności od schematu podawania kofeiny (tj. dawki i czasu trwania podawania): 200 mg doustnie 2 razy dziennie przez okres 7 dni (grupa 1); 200 mg doustnie 2 razy dziennie przez okres 14 dni (grupa 2); oraz 200 mg doustnie 3 razy dziennie przez okres 7 dni (grupa 3). Płytki krwi tych osób badano przed rozpoczęciem przyjmowania kofeiny (dzień 0) oraz po 1, 12, 60 i 108 godzinach od przyjęcia ostatniej dawki kofeiny. W szczególności, 1-godzinny punkt czasowy był badany tylko w grupie otrzymującej maksymalną dawkę kofeiny (600 mg/d). EC50 i IC50 w badaniach czynnościowych nie można było uzyskać w 1 godzinie z powodu problemów praktycznych związanych z nadmiernym pobieraniem krwi w wąskim przedziale czasowym (od 1 do 12 godzin).

Badanie wiązania SCH 58261 w błonach ludzkich płytek krwi

Błonę z ludzkich płytek krwi przygotowano zgodnie z wcześniejszym opisem16 i wykorzystano do badań wiązania radioligandu z SCH 58261 zgodnie z opisem Varaniego i wsp.17. W badaniach nasycenia, błony ludzkich płytek krwi były inkubowane z 8 do 10 różnymi stężeniami SCH 58261 w zakresie od 0,01 do 10 nmol/L. Wiązanie niespecyficzne określano w obecności NECA 10 μmol/L. Po 60 minutach inkubacji w 4°C, próbki były filtrowane przez filtry Whatman GF/B za pomocą Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Do komputerowej analizy danych z eksperymentów saturacji użyto ważonego nieliniowego programu do dopasowywania krzywych metodą najmniejszych kwadratów, LIGAND,18.

Pomiar poziomów cAMP w ludzkich płytkach krwi

Płytki krwi uzyskane z krwi obwodowej zdrowych ochotników przygotowano w sposób opisany wcześniej.16 Płytki krwi (6×104 do 8×104 komórek) inkubowano z 1,0 U deaminazy adenozyny/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoksy-4-metoksybenzylo)-2-imidazolidynonu (Ro 20-1724) jako inhibitora fosfodiesterazy oraz 6 do 8 różnych stężeń HE-NECA. Wartości EC50 uzyskano z krzywych stężenie-odpowiedź po transformacji log-logit zmiennych zależnych metodą najmniejszych kwadratów ważonych.19 Końcowy roztwór wodny badano pod kątem poziomu cAMP metodą kompetycyjnego testu wiązania białek.15

Platelet Aggregation Assay

Cytrowaną krew ludzką odwirowywano przy 200g przez 10 minut w celu uzyskania osocza bogatopłytkowego i przy 2500g przez 20 minut w celu uzyskania osocza ubogopłytkowego. Liczenie ludzkich płytek krwi przeprowadzono w liczniku Coultera model S8/80 (Coulter Electronics Inc) i skorygowano do 2.5×108/mL do 3.5×108/mL z autologicznym osoczem ubogopłytkowym. Agregację płytek krwi przeprowadzono zgodnie z turbidymetryczną techniką Borna20 za pomocą urządzenia DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Po inkubacji przez 3 minuty z 6 do 8 różnymi stężeniami HE-NECA, osocze bogatopłytkowe agregowano w temperaturze 37°C pod ciągłym mieszaniem z ADP. Podobne eksperymenty przeprowadzono z ADP w różnych stężeniach (100 nmol/L do 100 μmol/L). Maksymalną agregację, zarejestrowaną 5 minut po dodaniu ADP, wykorzystano do analizy ilościowej, a procent inhibicji obliczono w stosunku do wartości kontrolnych.21

Pomiary cytoplazmatycznego stężenia wolnego Ca2+

Cytozolowe stężenie wolnego wapnia mierzono za pomocą techniki fura 2 według Paula i wsp.22. Krótko mówiąc, płytki krwi inkubowano w całkowitej ciemności przez 30 minut w temperaturze 37°C z 1 μmol/L furą 2-AM i mieszano magnetycznie w kuwetach fluorymetrycznych (LS50, Perkin Elmer, Ltd) w stężeniu 108/mL w obecności 250 μmol/L sulfinpyrazonu. Wewnątrzkomórkowe stężenie Ca2+ (i) oznaczano przy stosunku wzbudzenia 340/380 i długości fali emisyjnej 505 nm.

Analiza statystyczna

Analizę danych przeprowadzono metodą 1-way ANOVA. Analizę różnic pomiędzy grupami leczonymi kofeiną (12, 60 i 108 godzin) a grupą kontrolną przeprowadzono za pomocą testu t-Studenta (analiza niesparowana). Różnice uznano za istotne przy wartości P<0,01. Wszystkie dane przedstawiono jako średnie±SEM.

Wyniki

Płytki krwi z 3 grup badanych pobierano przed rozpoczęciem podawania kofeiny (dzień 0, kontrola) oraz po 1, 12, 60 i 108 godzinach od podania ostatniej dawki (odstawienie kofeiny). Tabela podsumowuje wyniki eksperymentów wiążących i funkcjonalnych z 3 grup badanych.

Grupa 1 (400 mg/d przez 1 tydzień)

Parametry wiążące ujawniły kontrolną wartość Bmax wynoszącą 105±6 fmol/mg białka i wartość KD wynoszącą 1,28±0,08 nmol/L. W kontrolnych płytkach krwi HE-NECA zwiększała poziom cAMP z EC50 60±5 nmol/L i hamowała (1) agregację z IC50 86±10 nmol/L oraz (2) poziom wapnia z IC50 104±8 nmol/L. Nie stwierdzono istotnych statystycznie różnic w parametrach wiążących i funkcjonalnych w 12, 60 i 108 godzin po odstawieniu kofeiny (Tabela).

Grupa 2 (400 mg/d przez 2 tygodnie)

Parametry wiążące ujawniły kontrolną wartość Bmax wynoszącą 110±3 fmol/mg białka i wartość KD wynoszącą 1,21±0,09 nmol/L. W 12 i 60 godzin po odstawieniu kofeiny gęstość receptorów, Bmax, wzrosła w obu punktach czasowych o około 20%, ale wartości KD pozostały niezmienione. Eksperymenty funkcjonalne wykazały, że agonista receptora adenozyny A2A HE-NECA był istotnie silniejszy w zwiększaniu stężenia cAMP w płytkach krwi (tj. wartości EC50 były odpowiednio o 45% i 65% mniejsze w 12 i 60 godzinie po odstawieniu kofeiny niż wartości kontrolne). Podobny trend zaobserwowano w wartościach IC50 uzyskanych w eksperymentach agregacyjnych i pomiarach stężenia wolnego wapnia w cytoplazmie (Tabela).

Grupa 3 (600 mg/d przez 1 tydzień)

Ogółem, uzyskaliśmy dane podobne do tych z grupy 2. SCH 58261 wiązał się z pojedynczą klasą powinowactwa miejsc w błonach płytek krwi pochodzących z kontroli z Bmax wynoszącym 100±4 fmol/mg białka i KD wynoszącym 1,27±0,09 nmol/L. Jak pokazano na rycinie 1A, w błonach z płytek krwi pobranych w 1, 12, 60 i 108 godzin po odstawieniu kofeiny, radioligand wiązał się z tym samym powinowactwem, ale liczba miejsc wiążących (Bmax) była znacznie (P<0,01) zwiększona. W równoległych badaniach określono funkcjonalną odpowiedź płytek krwi na agonistę receptora A2A – HE-NECA. Jak podsumowano w tabeli, siła HE-NECA do (1) zwiększania tworzenia cAMP, (2) hamowania agregacji płytek indukowanej ADP, i (3) zmniejszania poziomu wapnia była znacząco zwiększona w płytkach uzyskanych w 12, 60 i 108 godzin po odstawieniu kofeiny (Figura 1B, 1C, i 1D). Eksperymenty przeprowadzono również w celu ustalenia, czy wzrostowi gęstości receptorów A2A towarzyszyłoby zmniejszenie siły i / lub wydajności ADP w celu wywołania agregacji. Wartości EC50 ADP stymulującego agregację płytek krwi w 12, 60 i 108 godzin po odstawieniu kofeiny wynosiły odpowiednio 0,7±0,2, 0,9±0,1 i 0,8±0,1 μmol/L, wartości nie różniące się istotnie od 0,9±0.2 μmol/L uzyskanych w płytkach krwi pochodzących z kontroli (Rycina 2).

Dyskusja

Skutki długotrwałego podawania kofeiny u ludzi i zwierząt oraz jej rola w ich tolerancji na działania kofeiny są kontrowersyjne. W niektórych badaniach wykazujących wzrost receptorów A1 w mózgu myszy znaleziono dowody na zależną od dawki upregulacji receptorów A1 przez kofeinę.23 Inne badania wykazały upregulacji receptorów A2A, sugerując adaptacyjny efekt przyjmowania kofeiny.24 Ponadto przewlekłe spożywanie kofeiny może prowadzić do zmniejszenia agregacji płytek krwi w wyniku upregulacji receptorów A2A zlokalizowanych na powierzchni płytek14 , odgrywających potencjalną rolę w procesach patofizjologicznych, takich jak agregacja i trombogeneza. Mimo że zmiany te mogą przyczyniać się do zaburzeń funkcji płytek krwi, tolerancja na kofeinę nie zmienia siły działania tej ksantyny jako kompetycyjnego antagonisty działania adenozyny.25 W zjawisko tolerancji mogą być zaangażowane inne zmiany, takie jak przesunięcie powinowactwa receptorów do stanu wysokiego powinowactwa, zmiany poziomu białek G lub sprzężenia tych białek z receptorami adenozynowymi, czy też długotrwałe zajęcie receptorów.26. U ludzi występują objawy odstawienia kofeiny; zwykle są to: ból głowy, zmęczenie, apatia i senność.9 W szczególności kofeina zwiększa stężenie adenozyny w osoczu, a jego zmniejszenie po odstawieniu antagonisty sugeruje receptorową regulację stężenia adenozyny w osoczu.27 Podczas niedokrwienia i/lub hipoksji adenozyna ma również działanie neuroprotekcyjne. W dorosłym mózgu przewlekłe leczenie kofeiną, które prowadzi do upregulacji receptorów adenozynowych, zmniejsza uszkodzenie niedokrwienne, podczas gdy ostra ekspozycja (efekt antagonistyczny receptora) zwiększa uszkodzenie niedokrwienne.28

Wykazano, że przewlekłe przyjmowanie kofeiny zmienia odpowiedź płytek krwi na działania adenozyny.14 Wielokrotne podawanie kofeiny (750 mg/d przez 1 tydzień) wykazało wzrost gęstości receptora A2A, któremu towarzyszyło uwrażliwienie odpowiedzi płytek, takie jak wzrost akumulacji cAMP i zmniejszenie agregacji płytek.15 Celem niniejszej pracy było określenie wpływu dawki kofeiny i czasu jej podawania na parametry wiążące i czynnościowe. W związku z tym badano zmiany gęstości i powinowactwa receptorów adenozyny A2A w błonach ludzkich płytek krwi u osób leczonych różnymi dawkami (400 lub 600 mg/d) przez różne okresy przyjmowania kofeiny (1 lub 2 tygodnie). Konkretnie, badaliśmy kontrolę (przed podaniem kofeiny) i osoby poddane działaniu kofeiny (1, 12, 60 i 108 godzin po ostatniej dawce kofeiny).

Leczenie kofeiną w dawce 400 mg/d przez 1 tydzień nie modyfikowało wiązania receptorów A2A i parametrów funkcjonalnych. Jednakże leczenie 400 mg/d przez 2 tygodnie lub 600 mg/d przez 1 tydzień powodowało (1) znaczący wzrost (upregulation) miejsc wiązania adenozyny A2A, (2) wzrost akumulacji cAMP, (3) wzrost działania antyagregacyjnego oraz (4) spadek poziomu wapnia wywołany agonistą receptora A2A HE-NECA.

Upregulacja receptorów A2A może być prawdopodobnie przypisana syntezie nowych receptorów podczas różnicowania komórek prekursorowych. Interpretacja ta opiera się na wynikach eksperymentów in vitro, w których wykazano, że inkubacja osocza bogatopłytkowego od osób z grupy kontrolnej przez okres 6 lub 12 godzin z kofeiną lub SCH 58261 nie miała wpływu na parametry wiązania.15 Wzrost regulacji receptorów adenozyny A2A spowodowany przewlekłym przyjmowaniem kofeiny można interpretować jako wskazanie, że endogenna adenozyna ma toniczny wpływ na ludzkie płytki krwi, a obecność antagonisty jest równoważona przez wzrost receptorów A2A. U dorosłych kofeina jest skutecznie adsorbowana z przewodu pokarmowego; szczytowe stężenie w osoczu występuje po 15 do 120 minutach od spożycia, a okres półtrwania kofeiny wynosi od 2,5 do 4,5 godziny.7 Wzrost receptorów adenozyny A2A stwierdzony w 1 godzinę po ostatniej dawce leczenia kofeiną był podobny do tego uzyskanego w 12 lub 60 godzin po odstawieniu kofeiny, co wskazuje, że odstawienie nie było konieczne do upregulacji receptorów A2A.

Innym celem obecnego badania było określenie, czy zmiany w parametrach wiązania korelowały ze zmianami w odpowiedzi funkcjonalnej (odpowiedzi). Stwierdzono, że agregacja płytek krwi była związana z aktywacją cyklazy adenylanowej oraz ze wzrostem wewnątrzkomórkowego stężenia wapnia. Siła działania HE-NECA w 12, 60 i 108 godzin po odstawieniu kofeiny była znacząco zwiększona w porównaniu z grupą kontrolną. Wyniki te wskazują, że wielokrotne podawanie różnych dawek kofeiny prowadzi do istotnych zmian w liczbie receptorów A2A na powierzchni płytek krwi, czemu towarzyszy zwiększona reaktywność na stymulację receptora. Klasyczny receptor adenozyny A2A jest odpowiedzialny za antyagregacyjne właściwości adenozyny i jej analogów, co jest zgodne z obserwacją, że agregacja jest bardziej wydajna u myszy pozbawionych receptorów A2A.8 Jednak agregacja płytek krwi indukowana przez rosnące stężenia ADP nie różniła się istotnie między osobami kontrolnymi i leczonymi kofeiną. Jednym z możliwych wyjaśnień tej ostatniej obserwacji jest to, że nie ma wystarczającej ilości adenozyny w medium testowym, aby wywołać odpowiedź. Alternatywnie, u osób leczonych kofeiną, wielkość wzrostu receptorów (tj. liczba receptorów) nie była wystarczająca do wytworzenia przesunięcia krzywej stężenie-odpowiedź na agregację indukowaną ADP. Jednakże, gdy poziom endogennej adenozyny wzrasta, tak jak podczas niedokrwienia mięśnia sercowego, pozakomórkowe stężenie adenozyny szybko wzrasta do poziomu wystarczającego do działania na wyregulowane receptory i może mieć większe efekty hamujące płytki niż kontrola. Dlatego możliwe jest, że przewlekłe spożycie kofeiny w dawkach nie odbiegających od średniego spożycia w diecie może prowadzić do paradoksalnego zmniejszenia agregacji płytek krwi podczas niedokrwienia.

W podsumowaniu, wszystkie dane razem dostarczają dalszych dowodów, że przewlekłe spożycie kofeiny zmienia odpowiedź płytek krwi na działania adenozyny. Głównym wnioskiem z niniejszego badania jest to, że wpływ przewlekłego spożycia kofeiny na funkcje płytek krwi jest zależny zarówno od dawki, jak i czasu trwania leczenia i leży u podstaw zmniejszenia agregacji płytek krwi z powodu upregulacji receptorów adenozyny A2A.