Cells of the adult human heart

Raportowanie danych

Nie stosowano żadnych metod statystycznych do wstępnego określenia wielkości próby. Eksperymenty nie były randomizowane, a badacze nie byli zaślepieni do alokacji podczas eksperymentów i oceny wyników.

Etyka badawcza dla tkanek dawców

Tkanki serca (dawcy D1-D7 i D11) zostały przetworzone w Wellcome Sanger Institute (Hinxton, Wielka Brytania) i uzyskane od zmarłych dawców narządów do przeszczepu po zatwierdzeniu przez Komitet Etyki Badań (ref 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee) i świadomej zgodzie rodzin dawców. Tkanki serca (dawcy H2-H7) zostały przetworzone w Harvard Medical School (Boston, Massachusetts, USA) i uzyskane od zmarłych dawców narządów po zatwierdzeniu przez Human Research Ethics Board Pro00011739 (University of Alberta, Edmonton, Kanada). Świadoma zgoda rodzin dawców została uzyskana za pośrednictwem instytucjonalnego programu Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE). Historia chorób układu sercowo-naczyniowego była nienaganna w przypadku wszystkich dawców (Tabela uzupełniająca 1).

Nabywanie i przetwarzanie tkanek

Tkanki pozyskano od dawców z Wielkiej Brytanii i Ameryki Północnej (D1-7 i 11, H2-7) po śmierci z przyczyn krążeniowych (DCD) (D2, D4-D7 i D11) oraz po śmierci mózgowej (DBD) (D1, D3, H2-H7). W przypadku dawców DCD z Wielkiej Brytanii, po pięciominutowej przerwie i w przypadku DBD, klatka piersiowa jest otwierana, aorta jest zaciskana poprzecznie i pobierane są próbki serca. W przypadku dawców z Ameryki Północnej DBD, aorta jest zaciskana poprzecznie, zimna kardioplegia (Celsior) jest podawana pod ciśnieniem przez aortę w celu zatrzymania bicia, serce jest wycinane, płukane w zimnym roztworze soli i pobierane są próbki. Wszystkie próbki od dawców były biopsjami mięśnia sercowego pełnej grubości z lewego i prawego przedsionka, lewej i prawej komory, przegrody międzykomorowej i koniuszka, z celowym wykluczeniem dużych nasierdziowych złogów tłuszczu. Próbki używane do izolacji pojedynczych jąder były błyskawicznie zamrażane i przechowywane w temperaturze -80 °C. Izolację pojedynczych komórek i wzbogacanie CD45+ przeprowadzano na świeżo pobranych próbkach. Pozostała tkanka po procedurach izolacji jąder i komórek została utrwalona w formalinie lub zamrożona w OCT do dodatkowych badań.

Wszystkie tkanki były przechowywane i transportowane na lodzie przez cały czas, aż do zamrożenia lub dysocjacji tkanki, aby zminimalizować jakąkolwiek degradację transkrypcji. Poprzednie badania nad pośmiertną stabilnością tkanek konsorcjum GTEx na tkankach luzem68 i w pojedynczych komórkach69 sugerują jedynie niewielkie zmiany w tkankach w ciągu pierwszych 24 h post mortem, gdy są przechowywane w warunkach chłodniczych.

Izolacja pojedynczych jąder

Jednolite jądra uzyskano z tkanek zamrożonych błyskawicznie przy użyciu homogenizacji mechanicznej, jak opisano wcześniej70. Tkanki homogenizowano przy użyciu szklanego zestawu do rozdrabniania tkanek Dounce (Merck) o pojemności 7 ml, wykonując 8-10 uderzeń luźnym tłuczkiem (A) i 8-10 uderzeń ciasnym tłuczkiem (B) w buforze homogenizacyjnym (250 mM sacharozy, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM ditiothreitol (DTT), 1× inhibitor proteazy, 0.4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1% Triton X-100 w wodzie wolnej od nukleaz). Homogenat filtrowano przez sitko komórkowe 40 μm (Corning). Po odwirowaniu (500g, 5 min, 4 °C) usunięto supernatant, a osad ponownie zawieszono w buforze do przechowywania (1× PBS, 4% surowicza albumina bydlęca (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn). Jądra wybarwiano odczynnikami NucBlue Live ReadyProbes (ThermoFisher), a pojedyncze jądra Hoechst-pozytywne oczyszczano za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS) przy użyciu influx, XDP lub FACSAria (BD Biosciences) (Ryc. 1 uzupełniająca). Oczyszczanie i integralność jąder weryfikowano pod mikroskopem, a jądra poddawano dalszej obróbce przy użyciu Chromium Controller (10X Genomics) zgodnie z protokołem producenta.

Przygotowanie pojedynczych komórek

Tkanki serca (0.2-0,9 g) przeniesiono z roztworu kardioplegicznego do delikatnych probówek C-MACS (Miltenyi Biotec) zawierających roztwór bazowy do trawienia enzymatycznego (100 μg ml-1 liberase TH Research grade i 50 μg ml-1 DNase I, HBSS 10 mM HEPES i 30 mM tauryny)71. Tkanki rozdrabniano przy użyciu nożyczek (FST) i automatycznie trawiono przy użyciu delikatnego dysocjatora Octo MACS (Miltenyi Biotec) z podgrzewaczami. Pozbawioną kardiomiocytów zawiesinę jednokomórkową przemywano roztworem podstawowym zawierającym 20% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) (Gibco), filtrowano przez 70-μm sitko nylonowe (BD Falcon), zbierano przez wirowanie (330g, 10 min, 4 °C) i ponownie zawieszano w roztworze podstawowym zawierającym 0,2% FBS (Gibco). Komórki były liczone ręcznie trzykrotnie przez wykluczenie błękitu Trypana po każdym wirowaniu i ponownie zawieszane w stężeniu co najmniej 2 × 106 ml-1. Pojedyncze komórki przetwarzano przy użyciu Chromium Controller (10X Genomics) zgodnie z protokołem producenta.

Wzbogacanie komórekCD45+

Zawiesinę komórek przygotowano jak opisano powyżej, a następnie znakowano przy użyciu mikroperełek sprzężonych z przeciwciałem monoklonalnym anty-ludzkim CD45 zgodnie z protokołem producenta (Miltenyi Biotec). W skrócie, do 107 komórek inkubowano przez 15 min w temp. 4 °C w 80 μl buforu PBS, BSA, EDTA (1× PBS pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) zawierającego 20 μl mikrogranulek CD45. Zawiesinę komórek przemywano raz w PBS, BSA, buforze EDTA i zbierano przez odwirowanie (330g, 10 min, 4 °C). Resuspensję komórek nanoszono na kolumny MACS LS (Miltenyi Biotec). Frakcja komórek pozbawionych CD45 była odrzucana po trzech przemyciach buforem PBS, BSA i EDTA, a frakcja komórek CD45+ była zbierana w buforze PBS, BSA i EDTA poprzez usunięcie kolumn z pola magnetycznego. Komórki CD45+ zostały policzone i ponownie zawieszone w PBS, BSA i buforze EDTA do stężenia co najmniej 2 × 106 na ml przed dalszym przetwarzaniem przy użyciu Chromium Controller (10X Genomics) zgodnie z protokołem producenta.

Przygotowanie biblioteki Chromium 10X

Pojedyncze komórki i jądra zostały policzone ręcznie przez wykluczenie błękitu Trypana lub automatycznie przy użyciu Countess II (Life Technologies) przy użyciu co najmniej dwóch oddzielnych liczeń. Zawiesina komórek lub jąder została dostosowana do 400-1,000 komórek na mikrolitr i załadowana do Chromium Controller (10X Genomics) z docelowym odzyskiem komórek lub jąder wynoszącym 4,000-10,000 na reakcję. Biblioteki ekspresji genów 3′ przygotowano zgodnie z instrukcjami producenta zestawów Chromium Single Cell Reagent Kits v2 lub v3 (10X Genomics). Kontrolę jakości cDNA i bibliotek końcowych przeprowadzono przy użyciu Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) lub 4200 TapeStation System (Agilent). Biblioteki były sekwencjonowane przy użyciu HiSeq 4000 (Illumina) w Wellcome Sanger Institute i NextSeq 500 (Illumina) w Harvard Medical School z minimalną głębokością 20 000-30 000 par odczytów na komórkę lub jądro (Tabela uzupełniająca 22).

Weryfikacja przestrzenna przy użyciu smFISH z sondami RNAscope

Podczas przygotowywania utrwalonych w formalinie próbek parafinowych (FFPE) świeża tkanka została utrwalona w neutralnie zbuforowanej 10% formalinie przez 18-36 h, a następnie osadzona w blokach parafinowych. Zamrożone próbki tkanek utrwalano w 4% paraformaldehydzie (ThermoFisher). Sekcje wycinano przy użyciu mikrotomu o grubości 5 μm i umieszczano na szkiełkach SuperFrost Plus (VWR). Szkiełka FFPE zostały automatycznie wybarwione przy użyciu BOND RX (Leica) i RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) zgodnie z protokołem producenta. Utrwalone, zamrożone szkiełka tkankowe przetwarzano zgodnie z protokołem RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio). Gotowe lub wykonane na zamówienie sondy docelowe RNAscope prowadzono równolegle do multipleksowych kontroli pozytywnych i negatywnych (Extended Data Fig. 12b, Supplementary Table 23). Wszystkie jądra były barwione DAPI. Wszystkie preparaty tkanek FFPE były obrazowane przy użyciu systemu Opera Phenix High-Content confocal Screening System (Perkin Elmer) z krokiem co 1 μm i obiektywem 20× z immersją wodną (NA 0,16, 0,299 μm na piksel). Kanały: DAPI (wzbudzanie 375 nm, emisja 435-480 nm), Atto 425 (wzbudzanie 425 nm, emisja 463-501 nm), opal 520 (wzbudzanie 488 nm, emisja 500-550 nm), opal 570 (wzbudzanie 561 nm, emisja 570-630 nm), opal 650 (wzbudzanie 640 nm, emisja 650-760 nm). Utrwalone, zamrożone preparaty tkankowe obrazowano za pomocą mikroskopu konfokalnego LSM710 (Zeiss) i obiektywu olejowego 40× (olej 1,3, DIC III). Kanały: DAPI (wzbudzenie 375 nm, emisja 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (wzbudzenie 492 nm, emisja 517 nm), Atto 550 (wzbudzenie 560 nm, emisja 575 nm) i Atto 647 (wzbudzenie 649 nm, emisja 662 nm). Wizualizacja i usuwanie tła (promień toczącej się kuli) zostały wykonane przy użyciu programu Fiji/ImageJ72. Pseudokolory zostały użyte dla lepszej wizualizacji.

Barwienie hematoksyliną i eozyną

Próbki tkanek zostały świeżo zamrożone w izopentanie (ThermoFisher) w temperaturze -80 °C i osadzone w OCT (VWR). Sekcje wycięto na grubość 10 μm przy użyciu mikrotomu, umieszczono na szkiełkach SuperFrostPlus (VWR) i poddano dalszej obróbce zgodnie ze standardowym protokołem barwienia hematoksyliną i eozyną (Extended Data Fig. 12a).

Pozyskiwanie tkanki mięśni szkieletowych

Próbki mięśni międzyżebrowych uzyskano z przestrzeni między drugim a trzecim żebrem po lewej stronie. Jest to zazwyczaj najgłębsza warstwa mięśnia (najbardziej oddalona od skóry). Próbki pobierano bezpośrednio do zimnego roztworu konserwującego.

Izolacja jąder dla mięśni szkieletowych

Tkankę mięśniową płukano w 1× PBS, oczyszczano z wszelkich widocznych złogów tłuszczu i rozdrabniano w celu uzyskania fragmentów o objętości około 1 mm3. Dla każdej próbki, około 0,3 g rozdrobnionych tkanek homogenizowano w 3 ml buforu A (250 mM sacharozy, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1× inhibitor proteazy) przy użyciu zestawu do rozdrabniania tkanek Dounce (Merck) z 50 uderzeniami luźnego tłuczka (A). Homogenat filtrowano przez sitko komórkowe o średnicy 100 μm (Corning), a sitko przemywano 1 ml, a następnie 750 μl buforu A. Po dodaniu Tritonu X-100 (stężenie końcowe 0,5%) mieszaninę homogenizowano dalej 50 uderzeniami ciasnego tłuczka (B). Po przefiltrowaniu przez sitko 40 μm, jądra odwirowywano (3000g, 5 min, 4 °C), ponownie zawieszano w 1 ml buforu B (320 mM sacharozy, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM octanu magnezu, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× inhibitor proteazy, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) i oczyszczano przy użyciu 27% roztworu gradientu Percolla. Mieszaninę Percolla odwirowano przy 20 000 g (15 min, 4 °C), a osad ponownie zawieszono w 200 μl buforu B, po czym odwirowano (20 000 g, 3 min, 4 °C). Po zabarwieniu błękitem trypanu, nienaruszone jądra liczono za pomocą hemocytometru. Jądra profilowano przy użyciu urządzenia Chromium Controller (10X Genomics) zgodnie z protokołem producenta.

Izolacja pojedynczych komórek dla mięśni szkieletowych

Tkankę mięśniową płukano w 1× PBS, oczyszczano z wszelkich widocznych złogów tłuszczu i drobno mielono. Następnie 2 g rozdrobnionej tkanki przenoszono do buforu trawiącego 1 (750 U ml-1 kolagenazy typu 2 w 1× PBS) i inkubowano w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej przez 90 min. Częściowo strawioną tkankę zebrano przez odwirowanie (650 g, 5 min, 4 °C), a osad ponownie zawieszono w buforze trawiącym 2 (100 U ml-1 kolagenazy typu 2, 2 U ml-1 dyspazy w PBS). Po 30 min inkubacji w temp. 37 °C w łaźni wodnej, trawienie zatrzymywano przez dodanie 2% FBS. Komórki filtrowano przez 100-μm i 40-μm sitko nylonowe (BD Falcon), zbierano przez wirowanie (650g, 4 °C, 3 min) i przemywano 1× PBS, 2% FBS. Następnie do oczyszczania komórek zastosowano 20% gradient Percolla (15,000g, 4 °C, 20 min). Warstwa zawierająca komórki była zbierana, płukana w PBS zawierającym 2% FBS, a żywe komórki były liczone przez wykluczenie błękitu trypanu przy użyciu hemocytometru. Jądra były profilowane przy użyciu Chromium Controller (10X Genomics) zgodnie z protokołem producenta.

Tabela kluczowych zasobów metod znajduje się w Tabeli uzupełniającej 24.

Mapowanie transkryptomu

Po sekwencjonowaniu próbki były demultipleksowane i przechowywane jako pliki CRAM. Każda próbka została zmapowana do ludzkiego genomu referencyjnego (GRCh38 v.3.0.0) dostarczonego przez 10X Genomics i przy użyciu pakietu CellRanger (v.3.0.1) z domyślnymi parametrami. Próbki jednokomórkowe były mapowane względem dostarczonej referencji. Próbki pojedynczych jąder, referencja dla pre-mRNA, została utworzona przy użyciu instrukcji 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Przetwarzanie danych zliczeniowych

Po mapowaniu, próbki z każdego źródła danych (pojedyncze jądra, pojedyncze komórki i komórki CD45+) zostały pogrupowane w indywidualne obiekty AnnData poprzez konkatenację raw_feature_bc_matrix_h5.h5 i dodanie odpowiednich informacji metadanych. Dla każdego obiektu źródła danych obliczono średnią unikalnych identyfikatorów molekularnych (UMI) (n_counts) i użyto jej jako progu dla pustych kropli.

Detekcja dubletów

Po usunięciu pustych kropli zastosowaliśmy scrublet73, aby przypisać wynik dubletów (scrublet_score) do każdej komórki. Komórki te zostały zgrupowane i zwizualizowane przy użyciu metody UMAP74. Dodatkowo, każda komórka została przetworzona do wykrywania dubletów przy użyciu metody perkolacji, aby umożliwić lepsze wykrywanie dubletów75.

Kontrola jakości komórek i filtrowanie

Każde źródło danych zostało przetworzone i anotowane oddzielnie, aby uwzględnić specyficzne dla źródła różnice jakości. Metryki te zostały włączone jako zmienne do dalszego przetwarzania. Komórki całkowite i komórki CD45+ były filtrowane dla zliczeń (500 < n_counts <15,000), genów (200 < n_genes), genów mitochondrialnych (procent_mito <20%), genów rybosomalnych (procent_ribo <20%) i wyniku scrublet (scrublet_score <0,3). Pojedyncze jądra filtrowano dla counts (500 < n_counts <15,000), genów (300 < n_genes <6,000), genów mitochondrialnych (percent_mito <5%), genów rybosomalnych (percent_ribo <5%) i scrublet score (scrublet_score <0.3). Te same progi filtrowania zastosowano do zbioru danych dotyczących mięśni szkieletowych.

Scanpy toolkit 1.576 w Pythonie v.3.7 został użyty do przeprowadzenia analiz downstream, w tym normalizacji (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10,000), transformacji logicznej (log1p), wykrywania zmiennych genów (highly_variable_genes), regresji niepożądanych źródeł zmienności (regress_out: n_counts i percent_mito), skalowania cech danych (scale: max_value = 10) i PCA (pca: using highly variable genes), jak opisano wcześniej77.

Wyrównanie partii przy użyciu głębokiego wariacyjnego autoenkodera

Zbudowaliśmy globalny kolektor poprzez wyrównanie wszystkich źródeł danych i dawców w naszych danych. Zostało to wykonane w trzyetapowej procedurze: (1) Każde źródło przeanalizowano i anotowano osobno, wyrównując tylko dla dawców za pomocą kroku regresji liniowej w przestrzeni perycytów przed wyrównaniem wsadowym z bbknn78. Różnicowo wyrażone geny (DEG) zostały obliczone przy użyciu testu sumy rang Wilcoxona z korektą Bonferroniego-Hochberga, jak zaimplementowano w programie Scanpy. (2) Aby przypisać każdy klaster, zastosowaliśmy podejście integracyjne, wyszukując najlepsze znaczące DEGs (P < 1 × 10-5) z logFC >1 przeciwko bazom danych ToppFun79 i EnrichR80. Istotne trafienia dotyczące szlaków, regulacji transkrypcji i procesów biologicznych zostały uszeregowane pod względem ważności w celu przypisania danego klastra. Każdy przedział komórkowy został oznaczony w slocie adata.obs po pogrupowaniu specyficznych dla źródła stanów komórek. (3) Wszystkie źródła zostały połączone w jeden obiekt AnnData pod etykietą adata.obs. Partie zostały wyrównane przy użyciu funkcji batch_correction z wariacyjnego autoenkodera scGen81. Najpierw wyrównano dla adata.obs, używając adata.obs jako kotwicy. Następnie wyrównaliśmy dla adata.obs, używając adata.obs jako kotwicy. Każda runda wyrównywania partii przebiegała przez 50 epok.

Populacje adipocytów, serca naczyniowego i immunologicznego, jak również analiza mięśni szkieletowych, zostały utworzone przy użyciu tej metody, a dokładność grupowania została oceniona przy użyciu SCCAF82 (Extended Data Fig. 12d).

DEGs

Aby pomóc w adnotacji subpopulacji każdego przedziału komórkowego, obliczyliśmy DEGs przy użyciu testu sumy rang Wilcoxona, jak zaimplementowano w przepływie pracy scanpy i zalecane przez ostatnie badania porównawcze83. Gen został uznany za różnie wyrażony, jeśli miał log2-transformowaną zmianę fałdową > 1 i P < 1 × 10-5, chyba że stwierdzono inaczej w sekcji analizy.

Interakcje komórka-komórka

Macierze ekspresji badanych populacji zostały wyeksportowane z AnnData, wraz z tabelą metadanych, która zawierała kody kreskowe komórek jako indeksy. Następnie uruchomiliśmy CellPhoneDB w następujący sposób: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. Surowe predykcje CellPhoneDB zostały przefiltrowane przez usunięcie tych interakcji, które miały P > 1,0 × 10-5. Istotne pary zostały następnie przekazane do analizy wzbogacania zestawu genów w ReactomeDB, enrichR i ToppFun w celu klasyfikacji funkcjonalnej. Komórki naczyniowe zostały losowo podpróbkowane do 39 000 komórek przed analizą, a grupa naprawcza serca (kardiomiocyty przedsionkowe i komorowe, FBs i komórki immunologiczne) została losowo podpróbkowana do 69 295 komórek przed analizą.

Wizualizacja ekspresji genów na danych 10X Genomics Visium

Przetworzyliśmy publicznie dostępne dane Visium miokardium lewej komory z 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) przy użyciu przepływu pracy Scanpy v.1.5 dostosowanego do analizy danych 10X Genomics Visium (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). W skrócie, usunięto plamy z mniej niż 500 UMIs lub więcej niż 20 000 UMIs i mniej niż 200 genów. Dane zostały przekształcone w log i znormalizowane przed wykreśleniem.

Oszacowanie prędkości RNA

Aby obliczyć prędkość RNA pojedynczych komórek i pojedynczych komórek wzbogaconych o CD45+, użyliśmy wyjściowego pliku BAM CellRanger i pliku GENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) wraz z velocyto84 CLI v.0.17.17 do wygenerowania pliku krosna zawierającego kwantyfikację spliced i unspliced RNA. Następnie zbudowaliśmy manifold, klasteryzowaliśmy komórki i wizualizowaliśmy prędkości RNA używając scVelo85.

Analizy subpopulacyjne kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych, fibroblastów i komórek neuronalnych

Wszystkie kody kreskowe oznaczone w obiekcie globalnym jako kardiomiocyty, fibroblasty i komórki neuronalne zostały wybrane do dalszych analiz subpopulacyjnych. Dodatkowe kryteria filtrowania specyficzne dla populacji komórek zastosowano do jąder w następujący sposób: kardiomiocyty counts (n_counts <12,500), geny (n_genes <4,000), geny mitochondrialne (percent_mito <1%), geny rybosomalne (percent_ribo <1%) i scrublet score (scrublet_score <0.25); geny mitochondrialne FB (percent_mito <1%), geny rybosomalne (percent_ribo <1%); geny komórek neuronalnych (n_genes <4000), geny mitochondrialne (percent_mito <1%), geny rybosomalne (percent_ribo <1%). Komórki całkowite i CD45+ zostały wykluczone w zestawach danych kardiomiocytów przedsionkowych i komorowych i nie przyczyniły się do analizy subpopulacji. Nie stosowano dalszego filtrowania FBs lub komórek neuronalnych ogółem i komórek CD45+. Kardiomiocyty i FBs zostały następnie podzielone na dwie grupy w oparciu o region pochodzenia: (1) lewy i prawy przedsionek oraz (2) lewa i prawa komora, koniuszek i przegroda międzykomorowa.

Efekty dawcy zostały wyrównane zgodnie z opisem w kroku (1) powyżej. Dla FB i komórek neuronalnych, źródła zostały wyrównane zgodnie z opisem w kroku (3) powyżej. Wykonano klasteryzację Leiden i wizualizację UMAP w celu identyfikacji subpopulacji i wizualizacji86. Różnicowo wyrażone geny zostały obliczone przy użyciu testu sumy rang Wilcoxona. Geny uszeregowano według wyniku.

Porównanie międzytkankowe populacji immunologicznych serca z populacjami immunologicznymi mięśni szkieletowych, nerek i krwi

Zebraliśmy dane transkryptomu jednokomórkowego dla dorosłych nerek z ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/), i podzestawiliśmy wszystkie komórki odpornościowe zgłoszone w ich badaniu. Dla SKM wybraliśmy anotowane komórki odpornościowe z połączonego kolektora. W przypadku ludzkiej krwi wykorzystaliśmy publicznie dostępny zestaw danych 10 000 pojedynczych komórek PBMC dostarczony przez 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3). Jak opisano wcześniej87, wytrenowaliśmy model regresji logistycznej na komórkach odpornościowych serca przy użyciu 80% danych ekspresji i przetestowaliśmy jego dokładność na pozostałych 20%, aby uzyskać model o dokładności 0,6862 (Extended Data Fig. 8f, Tabela uzupełniająca 16). Następnie zastosowaliśmy ten model do przewidywania analogowych populacji immunologicznych serca w dorosłej nerce, SKM i PBMCs. Przewidywania z prawdopodobieństwem mniejszym niż 0,8 zostały wykluczone z dalszych analiz porównawczych.

Analiza wzbogacania ontologii genów

Dla populacji kardiomiocytów komorowych użyliśmy pakietu R gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) z listą genów ocenionych przez vCM4 jako wejście i zestawem genów wyrażonych w kardiomiocytach komorowych jako tło (te geny mające liczbę UMI >1). Aby przeprowadzić analizę ontologii genów na komórkach naczyniowych, 500 najlepszych znaczących DEGs (P < 1 × 10-5) z log-transformowaną zmianą fałdu > 1 przeszukano w stosunku do bazy danych procesów biologicznych Gene Ontology przy użyciu ToppFun79 (Tabela uzupełniająca 25). Wybrano pięć najlepszych, istotnie wzbogaconych terminów (q < 0,05) dla każdej subpopulacji i naniesiono je na mapę ciepła. Aby przeprowadzić analizę szlaków na adipocytach, 500 najlepszych znaczących DEGs (P < 1 × 10-5) z log-transformowaną zmianą fałdu > 0,5 przeszukano w bazach szlaków ToppFun79 (Tabela uzupełniająca 26). Wybrano pięć najlepszych znacząco wzbogaconych ścieżek (q < 0,05) dla każdej subpopulacji i naniesiono je na mapę ciepła.

Gene set score

Użyliśmy funkcji score_genes zaimplementowanej w scanpy, aby obliczyć wzbogacenie genów zaangażowanych w ścieżkę Oncostatin M. Lista genów została zebrana na podstawie badań literaturowych88,89. Do wzbogacenia zestawu genów wzięto pod uwagę tylko geny o wysokiej ekspresji, aby zredukować szum (ponad 500 UMI we wszystkich komórkach). Tę samą analizę przeprowadzono w celu porównania komórek odpornościowych serca w naszym badaniu z obserwacjami z poprzednich badań nad makrofagami rezydującymi w sercu51, makrofagiem remodelującym tkanki myszy45 i pochodzeniem z woreczka żółtkowego90.

Statystyka i odtwarzalność

Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu oprogramowania R, v.3.6.1. Testy t-Studenta zostały użyte do porównania rozkładów typów komórek w każdym miejscu. P < 0,05 uznano za istotne statystycznie. Modele regresji liniowej (korelacje) uzyskano przy użyciu funkcji R linear model (lm), która szacuje statystyczne prawdopodobieństwo (wartość P) zależności liniowej. Zastosowano korektę Bonferroniego dla testów wielokrotnych.

Przedstawione na rycinach mikrografy RNAscope są reprezentatywne. Mikrografy na ryc. 2g, 3c, h oraz Extended Data Fig. 3c (HAMP), Extended Data Fig. 3e (CNN1), Extended Data Fig. 4g, m, 6f zostały powtórzone z podobnymi wynikami w dwóch pojedynczych przekrojach tkankowych. Mikrografy na ryc. 2h, 3f oraz Extended Data Fig. 3c (CNN1), Extended Data Fig. 3e (PCDH7), Extended Data Fig. 6e, h, 9d powtórzono z podobnymi wynikami w trzech pojedynczych przekrojach tkankowych. Mikrografy z ryc. 1e, 2d, 3e oraz Extended Data Fig. 1f, 3c (FHL1) i Extended Data Fig. 6d powtórzono z podobnymi wynikami w czterech pojedynczych przekrojach tkankowych. Mikrografy na Rys. 2c i Extended Data Rys. 3c (PRELID2), Extended Data Rys. 10e, 12a zostały powtórzone z podobnymi wynikami w sześciu lub więcej pojedynczych przekrojach tkanek. Kontrole pozytywne i negatywne przeprowadzono raz na używane próbki.

Analiza wzbogacania GWAS

Pobraliśmy statystyki podsumowujące GWAS z szerokiego cvdi, katalogu EBI GWAS i atlasu GWAS. Wybraliśmy cechy z dobrze zasilonymi GWAS (n > 5,000 i liczba znaczących loci >10). Zestawienie zbiorów danych GWAS przedstawiono w Tabeli Dodatkowej 27. Dane dotyczące ekspresji genów kodujących białka zostały zmapowane na identyfikatory genów Entrez i te adnotacje genów zostały wykorzystane w zestawieniu genomu ludzkiego hg19/37. Używaliśmy tylko danych o ekspresji genów z jąder komórkowych. Zaimplementowaliśmy analizę opisaną wcześniej64 w pythonie i w R. Liczby log-transformowane (plus jedna pseudokonta) zostały użyte do obliczenia średnich profili ekspresji specyficznych dla danego typu komórki. Przeprowadziliśmy indywidualne analizy magmowe dla każdego typu komórek, zawsze warunkując domyślne kowarianty na poziomie genu (na przykład długość genu) i średnią ekspresję genu we wszystkich komórkach. Następnie zastosowaliśmy metodę Benjamini-Hochberga i wybraliśmy asocjacje cech typu komórkowego z FDR < 10%. Te pary zostały następnie poddane analizie warunkowej, jak wcześniej opisano64, aby zdefiniować „niezależne”, „wspólnie wyjaśnione” i „częściowo wspólnie wyjaśnione” pary asocjacji (Tabela uzupełniająca 28).

Dystrybucje rozproszonych komórek i izolowanych jąder

Różne procedury uzyskiwania izolowanych jąder i rozproszonych komórek spowodowały znacząco różne rozkłady typów komórek (Tabela uzupełniająca 29, Extended Data Fig. 2). Co znamienne, 30,1% i 49,2% izolowanych jąder pochodziło z kardiomiocytów w przedsionkach i komorach, podczas gdy te komórki były w większości wykluczone z preparatów izolowanych i wyselekcjonowanych komórek CD45 (Tabela uzupełniająca 2).

Z wyłączeniem kardiomiocytów, dystrybucja typów komórek zidentyfikowanych z izolowanych jąder i komórek rozproszonych pozostała odrębna (Tabela uzupełniająca 30). Chociaż 59,0% komórek rozproszonych stanowiły ECs, tylko 15,7% jąder pochodziło z ECs. Natomiast 64,2% jąder pochodziło z FBs (31,2%) i pericytów (33,0%), podczas gdy tylko 17,1% komórek rozproszonych stanowiły FBs (2,3%) i pericyty (14,8%). Różnice te mogą odzwierciedlać wrażliwość jąder EC na procedury izolacyjne lub odporność pericytów i FBs na trawienie enzymatyczne komórek.

Pomimo różnic w dystrybucji komórek między izolowanymi jądrami i rozproszonymi komórkami, profile ekspresji genów linii komórkowych były rozsądnie skorelowane (r > 0,4 dla każdego typu komórek). Aby zająć się zgodnością genów wychwyconych przez komórki i jądra, porównaliśmy ekspresję głównych markerów typów komórek z Fig. 1c w trzech źródłach (Extended Data Fig. 1c). Ponieważ w jądrach brakuje cytoplazmatycznego RNA, ekspresja niektórych genów, zwłaszcza genów immunologicznych NKG7 i C1QA, była niższa w jądrach niż w komórkach. Niemniej jednak ogólna tendencja w odniesieniu do genów markerowych była zgodna we wszystkich trzech źródłach, a te same geny wyróżniały poszczególne typy komórek niezależnie od źródła.

Dalsza analiza komórek naczyniowych

Komórki PC3_str zawierały podobny udział komórek i jąder i miały wynik scrublet poniżej zastosowanego rygorystycznego progu; niemniej jednak średnia liczba genów i zliczeń w tym klastrze była wyższa niż średnia. Tak więc, pomimo naszego rygorystycznego filtrowania jakości, nie możemy wykluczyć, że w tym klastrze mogą znajdować się dublety. EC10_CMC-like i PC4_CMC-like współekspresjonują geny EC lub pericyte z markerami kardiomiocytów i wymagane są dalsze badania, aby zrozumieć, czy reprezentują one wcześniej nieznane stany komórkowe lub dublety.

Obserwacje tętniczego i żylnego SMC są wspierane przez poprzednie badania, które przewidują, że tętnicze SMC są bardziej kurczliwe, a żylne SMC są mniej zróżnicowane91.

EC3_cap wzbogaca się o transkrypty kodujące składniki AP1 (JUN i FOS), które pośredniczą w wielu decyzjach dotyczących losu EC, w tym odpowiedzi na VEGF, sygnały zapalne i stresowe, oraz ATF3, gen odpowiedzi adaptacyjnej indukowany przez różne sygnały92,93,94.

Charakterystyka mięśni szkieletowych

Pobraliśmy próbki mięśni szkieletowych międzyżebrowych od pięciu zdrowych osób, w tym jednego dawcy z dopasowaną tkanką sercową, i profilowaliśmy transkryptom 35 665 pojedynczych komórek i 39 597 pojedynczych jąder. Analogicznie do serca, połączenie komórek i jąder pozwoliło nam uchwycić i rozwiązać główne linie komórkowe, w tym kardiomiocyty, fibroblasty, komórki śródbłonka, komórki mięśni gładkich, perycyty, komórki odpornościowe mieloidalne i limfoidalne oraz komórki satelitarne (Rozszerzone dane Fig. 11a, b, Tabela uzupełniająca 31).

Dalsza analiza komórek naczyniowych mięśni szkieletowych zidentyfikowała dziesięć odrębnych populacji. Komórki śródbłonka wykazały pięć klastrów oddzielonych na podstawie ich odpowiednich łóżek naczyniowych z sygnaturami podobnymi do tych, które obserwujemy w sercu. EC_cap wykazują ekspresję VWF i RGCC. Venous EC_ven wyrażają ACKR1 i PLVAP, podczas gdy tętnicze EC_art wykazują SEMA3G i HEY1, zgodnie z naszymi danymi dotyczącymi serca (Extended Data Fig. 11c, d, Supplementary Table 32).

Ogólne rozkłady populacji komórek naczyniowych i zrębowych w mięśniu szkieletowym i mięśniu sercowym były podobne, w tym tętnicze i żylne cechy ECs; jednak; mięsień szkieletowy zawierał pojedyncze skupisko SMC, potencjalnie związane z mniejszym rozmiarem zbioru danych. W mięśniu szkieletowym przewidywane interakcje komórka-komórka EC_art i SMCs obejmowały NOTCH1/4-JAG1, jak również JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, ale nie JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, wnioskowane w sercu (Extended Data Fig. 11e, f, Supplementary Table 33).

Komórki odpornościowe serca

Używając modelu regresji logistycznej, nie zidentyfikowaliśmy żadnego odpowiednika sercowych monocytów IL17RA+ w SKM lub nerce, prawdopodobnie ze względu na niewielki rozmiar tej populacji.

Zidentyfikowane nieaktywne komórki T (CD4+T_naive) wykazywały ekspresję CCR7 i SELL, wskazując na ich naiwną i rezydującą w tkankach naturę95. Komórki T pamięci (CD8+T_tem) wykazywały ekspresję BACH2, STAT4 i IL7R, związaną z długotrwałą pamięcią immunologiczną96,97. Dalej scharakteryzowaliśmy komórki limfoidalne używając scNym98 i wytrenowaliśmy go używając opublikowanych danych99,100. Otrzymany model został zastosowany do komórek odpornościowych serca i te komórki, których przewidywany wynik był wyższy niż 0,8, zostały uznane za prawdopodobnych kandydatów do ponownej anotacji. Stosując to podejście, zidentyfikowaliśmy kandydatów dla plazmocytowych komórek B (109), komórek dendrytycznych (645), wrodzonych komórek limfoidalnych (89), komórek T MAIT (219), komórek T helper (80), komórek regulatorowych T (11), komórek centralnej pamięci T (103), komórek T γδ (30) i plazmocytoidalnych komórek dendrytycznych (27). Adnotacje te można znaleźć w adnotacjach obiektów cardiac immune pod etykietą 'scNym’ na stronie www.heartcellatlas.org.

Podsumowanie

Dalsze informacje na temat projektu badań są dostępne w Nature Research Reporting Summary powiązanym z tym artykułem.

.