Podstawowy plan syntezy białek u eukariotów i archaidów jest podobny do tego u bakterii. Główne strukturalne i mechanistyczne tematy powtarzają się we wszystkich domenach życia. Jednak synteza białek eukariotycznych obejmuje więcej składników białkowych niż synteza białek prokariotycznych, a niektóre etapy są bardziej skomplikowane. Niektóre godne uwagi podobieństwa i różnice są następujące:
Rybosomy. Rybosomy eukariotyczne są większe. Składają się z dużej podjednostki 60S i małej podjednostki 40S, które razem tworzą cząsteczkę 80S o masie 4200 kd, w porównaniu z 2700 kd dla prokariotycznego rybosomu 70S. Podjednostka 40S zawiera 18S RNA, który jest homologiczny do prokariotycznego 16S RNA. Podjednostka 60S zawiera trzy RNA: 5S i 28S RNA są odpowiednikami prokariotycznych cząsteczek 5S i 23S; jej 5,8S RNA jest unikalne dla eukariotów.
TRNA inicjujące. U eukariotów aminokwasem inicjującym jest metionina, a nie N-formylometionina. Jednak, podobnie jak u prokariotów, w inicjacji uczestniczy specjalny tRNA. Ten aminoacylo-tRNA nazywany jest Met-tRNAi lub Met-tRNAf (indeks „i” oznacza inicjację, a „f” oznacza, że może on być formlowany in vitro).
Inicjacja. Kodonem inicjującym u eukariotów jest zawsze AUG. Eukarionty, w przeciwieństwie do prokariotów, nie używają specyficznej, bogatej w purynę sekwencji po stronie 5′ w celu odróżnienia inicjujących AUG od wewnętrznych. Zamiast tego, AUG znajdujący się najbliżej 5′ końca mRNA jest zwykle wybierany jako miejsce startu. Rybosom 40S przyłącza się do czapeczki na 5′ końcu eukariotycznego mRNA (rozdział 28.3.1) i poszukuje kodonu AUG, przesuwając się krok po kroku w kierunku 3′ (rysunek 29.33). Ten proces skanowania w syntezie białek eukariotycznych jest napędzany przez helikazy, które hydrolizują ATP. Sparowanie antykodonu Met-tRNAi z kodonem AUG mRNA sygnalizuje, że cel został odnaleziony. W prawie wszystkich przypadkach eukariotyczne mRNA ma tylko jedno miejsce startu i dlatego jest szablonem dla jednego białka. Natomiast mRNA prokariotyczne może mieć wiele sekwencji Shine-Dalgarno, a więc i miejsc startu, i może służyć jako szablon do syntezy kilku białek. Eukariota wykorzystuje o wiele więcej czynników inicjacji niż prokariota, a ich wzajemne oddziaływanie jest o wiele bardziej skomplikowane. Przedrostek eIF oznacza eukariotyczny czynnik inicjacji. Na przykład eIF-4E jest białkiem, które wiąże się bezpośrednio do czapeczki 7-metyloguanozyny (rozdz. 28.3.1), podczas gdy eIF-4A jest helikazą. Różnica w mechanizmie inicjacji między prokariotami i eukariotami jest po części konsekwencją różnicy w przetwarzaniu RNA. U prokariotów 5′ koniec mRNA jest łatwo dostępny dla rybosomów bezpośrednio po transkrypcji. U eukariotów natomiast, przed rozpoczęciem translacji, pre-mRNA musi zostać przetworzone i przetransportowane do cytoplazmy. W ten sposób istnieje wiele okazji do tworzenia złożonych struktur drugorzędowych, które muszą być usunięte, aby odsłonić sygnały w dojrzałym mRNA. Czapka 5′ stanowi łatwo rozpoznawalny punkt wyjścia. Ponadto, złożoność eukariotycznej inicjacji translacji dostarcza kolejnego mechanizmu ekspresji genów, który będziemy dalej badać w rozdziale 31.
Elongacja i terminacja. Eukariotyczne czynniki elongacyjne EF1α i EF1βγ są odpowiednikami prokariotycznych EF-Tu i EF-Ts. Forma GTP EF1α dostarcza aminoacylo-tRNA do miejsca A rybosomu, a EF1βγ katalizuje wymianę GTP na związany GDP. Eukariotyczna EF2 pośredniczy w translokacji napędzanej przez GTP w podobny sposób, jak prokariotyczna EF-G. Terminacja u eukariotów jest przeprowadzana przez jeden czynnik uwalniający, eRF1, w porównaniu z dwoma u prokariotów. Wreszcie, eIF3, podobnie jak jego prokariotyczny odpowiednik IF3, zapobiega reasocjacji podjednostek rybosomalnych w przypadku braku kompleksu inicjacyjnego.
Rysunek 29.33
Eukariotyczna inicjacja translacji. U eukariotów inicjacja translacji rozpoczyna się od utworzenia kompleksu na czapeczce 5′, w skład którego wchodzi podjednostka 40S i Met-tRNAi. Napędzany hydrolizą ATP, kompleks ten skanuje mRNA aż do pierwszego AUG (więcej…)
29.5.1. Wiele antybiotyków działa przez hamowanie syntezy białek
Różnice między rybosomami eukariotycznymi i prokariotycznymi mogą być wykorzystane do opracowania antybiotyków (tabela 29.4). Na przykład antybiotyk puromycyna hamuje syntezę białek, powodując uwalnianie rodzących się prokariotycznych łańcuchów polipeptydowych przed zakończeniem ich syntezy. Puromycyna jest analogiem terminalnej części aminoacylo-adenozynowej aminoacylo-tRNA (rysunek 29.34).
Tabela 29.4
Antybiotykowe inhibitory syntezy białek.
Rysunek 29.34
Antybiotykowe działanie puromycyny. Puromycyna przypomina aminoacylowy terminus aminoacyl-tRNA. Jej grupa aminowa łączy się z grupą karbonylową rosnącego łańcucha polipeptydowego, tworząc addukt, który odłącza się od rybosomu. Addukt ten jest stabilny, ponieważ (więcej…)
Wiąże się z miejscem A na rybosomie i hamuje wejście aminoacylo-tRNA. Ponadto puromycyna zawiera grupę α-aminową. Ta grupa aminowa, podobnie jak ta na aminoacylo-tRNA, tworzy wiązanie peptydowe z grupą karboksylową rosnącego łańcucha peptydowego. Produkt, peptyd posiadający na swoim karboksylowym końcu kowalencyjnie przyłączoną resztę puromycyny, odłącza się od rybosomu.
Streptomycyna, wysoce zasadowy trisacharyd, zakłóca wiązanie formylometionyl-tRNA do rybosomów i w ten sposób uniemożliwia prawidłowe rozpoczęcie syntezy białka. Inne antybiotyki aminoglikozydowe, takie jak neomycyna, kanamycyna i gentamycyna, ingerują w miejsce dekodujące znajdujące się w pobliżu nukleotydu 1492 w 16S rRNA podjednostki 30S (rozdział 29.3.9). Chloramfenikol działa poprzez hamowanie aktywności transferazy peptydylowej. Erytromycyna wiąże się z podjednostką 50S i blokuje translokację. Wreszcie, cykloheksamid blokuje aktywność transferazy peptydylowej w rybosomach eukariotycznych, stanowiąc użyteczne narzędzie laboratoryjne do blokowania syntezy białek w komórkach eukariotycznych.
29.5.2. Diphtheria Toxin Blocks Protein Synthesis in Eukaryotes by Inhibiting Translocation
Błonica była główną przyczyną śmierci w dzieciństwie przed pojawieniem się skutecznej immunizacji. Śmiertelne skutki tej choroby są spowodowane głównie toksyną białkową wytwarzaną przez Corynebacterium diphtheriae, bakterię, która rośnie w górnych drogach oddechowych zakażonej osoby. Gen kodujący toksynę pochodzi z lizogenicznego faga, który jest przenoszony przez niektóre szczepy C. diphtheriae. Kilka mikrogramów toksyny błoniczej jest zazwyczaj śmiertelne dla osoby niezaszczepionej, ponieważ hamuje ona syntezę białek. Toksyna jest rozszczepiana krótko po wniknięciu do komórki docelowej na 21-kd fragment A i 40-kd fragment B. Fragment A toksyny katalizuje kowalencyjną modyfikację ważnego składnika maszynerii syntezy białek, podczas gdy fragment B umożliwia fragmentowi A przedostanie się do cytozolu komórki docelowej.
Pojedynczy fragment A toksyny w cytozolu może zabić komórkę. Dlaczego jest to tak śmiertelne? Celem fragmentu A jest EF2, czynnik elongacyjny katalizujący translokację w syntezie białek eukariotycznych. EF2 zawiera difetamid, niezwykłą resztę aminokwasową o nieznanej funkcji, która powstaje w wyniku potranslacyjnej modyfikacji histydyny. Fragment A katalizuje przeniesienie jednostki rybozy adenozyno-difosforanu z NAD+ na atom azotu pierścienia difetamidowego (rysunek 29.35). Ta ADP-rybozylacja pojedynczego łańcucha bocznego EF2 blokuje jego zdolność do translokacji rosnącego łańcucha polipeptydowego. Synteza białek ustaje, co odpowiada za niezwykłą toksyczność toksyny błoniczej.
Rysunek 29.35
Blokowanie translokacji przez toksynę błoniczą. Toksyna błonicza blokuje syntezę białek u eukariotów poprzez katalizowanie przeniesienia jednostki ADP-rybozy z NAD+ na difetamid, zmodyfikowaną resztę aminokwasową w czynniku elongacji 2 (translokacja). Difetamid (więcej…)
.