2 Physiological Evidence of Endozepines
Synteza RO 15-1788 (lub flumazenilu, FLZ), pierwszego znanego antagonisty BZ (Hunkeler i in., 1981; Ramerstorfer, Furtmüller, Vogel, Huck, & Sieghart, 2010), ułatwiła dużą ilość badań wspierających hipotezę, że endogenne ligandy do miejsca wiążącego BZ istnieją i są funkcjonalnie istotne in vitro i in vivo. Chociaż FLZ jest cennym narzędziem do identyfikacji fizjologicznych działań BZ, jego zastosowanie do tego celu ma pewne ograniczenia. Na przykład, wykazano, że FLZ może wywierać efekty PAM w heterologicznie wyrażonych GABAARs, szczególnie w wysokich stężeniach (Ramerstorfer i in., 2010). Co ważne, nigdy nie wykazano, aby FLZ wywierała efekty NAM na heterologicznie wyrażone GABAARs, co sugeruje, że wszelkie efekty NAM FLZ na hamowanie pośredniczone przez GABA są najprawdopodobniej spowodowane antagonizmem endogennego liganda.
W badaniach in vitro zasugerowano szereg obwodów, w których endozepiny są konstytutywnie wyrażone i fizjologicznie aktywne, o czym świadczy tłumiące działanie FLZ na hamowanie pośredniczone przez GABA, głównie poprzez zmniejszenie czasu trwania odpowiedzi. Na przykład, FLZ tłumi IPSP(C)s w hipokampie (King, Knox, Dingledine, 1985; Krespan, Springfield, Haas, & Geller, 1984) i w hodowlach neuronów neokorowych (Vicini et al., 1986). Wykazano, że FLZ tłumi hamowanie w komórkach ziarnistych zakrętu zębatego w pilokarpinowym modelu padaczki płata skroniowego (Leroy, Poisbeau, Keller, & Nehlig, 2004) oraz tłumi hamowanie w neokorowych neuronach piramidowych warstwy II/III (Ali & Thomson, 2008). Długotrwałe wzmocnienie synaps hamujących w obszarze CA1 hipokampa było związane ze wzrostem amplitudy IPSC, które było tłumione przez FLZ (Xu & Sastry, 2005). Ostatnio wykazano, że FLZ tłumi neurony hamowania synaptycznego jądra siatkowatego wzgórza (nRt, Christian i wsp., 2013), wskazując na obecność endozepiny w tym jądrze. Łącznie, te badania z FLZ silnie wspierają obecność endogennej aktywności PAM w kilku odrębnych regionach mózgu, wskazując, że jest to szeroko realizowany endogenny mechanizm modulacyjny w OUN.
Liczba interesujących odkryć klinicznych jest zgodna z antagonizmem funkcji endozepiny przez FLZ. Na przykład, leczenie FLZ może wywołać ataki paniki u pacjentów z zaburzeniem panicznym, ale nie w zdrowych kontroli (Nutt, Glue, Lawson, & Wilson, 1990). Może również wytrącić większą odpowiedź paniczną u kobiet z przedmiesiączkowym zaburzeniem dysforycznym w porównaniu do kontroli (Le Mellédo, Van Driel, Coupland, Lott, & Jhangri, 2000) i odwrócić stupor związany z encefalopatią wątrobową (Als-Nielsen, Gluud, & Gluud, 2004; Baraldi et al., 2009). Łącznie badania te sugerują fizjologiczną rolę gromadzenia się endozepin w przestrzeni pozakomórkowej, tj. fizjologicznego nagromadzenia, w regulacji lęku/paniki. Ponadto stwierdzono, że poziom w surowicy substancji hamujących wiązanie FLZ z błonami móżdżku szczurów wzrasta dwukrotnie podczas porodu samoistnego, czego nie zaobserwowano u pacjentek poddanych cesarskiemu cięciu (Facchinetti, Avallone, Modugno, & Baraldi, 2006), co sugeruje, że stany fizjologiczne, takie jak poród, mogą powodować gromadzenie się endozepin.
Znaczenie tych ustaleń dla pacjentów z padaczką u ludzi pozostaje na razie nieznane, ponieważ dowody na działania endozepiny u pacjentów z padaczką są niejednoznaczne. FLZ może wywoływać napady u pacjentów, ale przynajmniej niektórzy pacjenci byli prawdopodobnie leczeni BZ (Spivey, 1992). Na przykład, w serii 67 pacjentów poddawanych ocenie przed operacją padaczki (Schulze-Bonhage & Elger, 2000), napady były prowokowane u 8 (12%) – wszyscy byli wcześniej leczeni BZ. Opisy przypadków sugerują pogorszenie napadów przez FLZ u niemowląt i u osób w podeszłym wieku (McDuffee & Tobias, 1995; Thomas, Lebrun, & Chatel, 1993). Zgłoszone skutki FLZ na drgawki w badaniach na zwierzętach są również mieszane. U szczurów młodszych niż 2 tygodnie, FLZ pogarsza drobne napady ruchowe wywołane przez PTZ (Rathouská, Kubová, Mares, & Vorlícek, 1993). W szczególności w modelach drgawkowych z zastosowaniem dużych dawek odnotowano albo tłumienie aktywności napadów (Kaijima, Le Gal La Salle, & Rossier, 1983) albo brak efektu (Hunkeler et al., 1981). W modelu GAERS genetycznej spontanicznej padaczki nieobecności, FLZ miała efekty zależne od stężenia, z niskimi dawkami tłumiącymi wyładowania spike-wave (SWDs) i wyższymi dawkami wzmacniającymi je (Marescaux et al., 1984). Ponadto wykazano, że mutacja genetyczna (R43Q) w ludzkiej podjednostce γ2, związana zarówno z rodzinną nieobecnością, jak i napadami gorączkowymi, znosi (Wallace i in., 2001) lub zmniejsza (Bowser i in., 2002) wrażliwość in vitro specyficznych GABAAR-ów na DZP. Mechanizm zwiększonej aktywności napadowej związanej z niewrażliwością receptorów na DZP, egzogenny ligand, nie jest jeszcze znany. Jedną z prowokacyjnych hipotez jest to, że mutacja powoduje niewrażliwość receptorów na naturalnie występujący endogenny BZ. Ponieważ endogenny BZ prawdopodobnie miałby właściwości przeciwnapadowe, mutacje w receptorze, które uniemożliwiają wiązanie endogennego BZ, powinny powodować napady. Jednakże, szlakowanie receptora jest również zaburzone przez tę mutację (Kang & Macdonald, 2004; Sancar & Czajkowski, 2004) i może przyczynić się do aktywności napadowej, więc rola endozepin w napadach związanych z mutacją γ2R43Q pozostaje kontrowersyjna.
FLZ została również zgłoszona w celu odwrócenia idiopatycznego nawracającego stuporu (Rothstein i in., 1992), chociaż w ostatnich latach stało się oczywiste, że co najmniej niektórzy pacjenci, którzy odpowiedzieli na FLZ mieli ukradkowe użycie BZ (Granot, Berkovic, Patterson, Hopwood, & Mackenzie, 2004) i to pole pozostaje kontrowersyjne (Cortelli et al., 2005). W ostatnim badaniu FLZ normalizowała czujność w dobrze scharakteryzowanej grupie pacjentów z hipersomnią. W płynie mózgowo-rdzeniowym (CSF) tych pacjentów stwierdzono aktywność peptydergicznego PAM (Rye et al., 2012). Jednakże, PAM nie oddziaływał z potencjalizacją przez BZ midazolam i częściowo utrzymywał się w α1(H101R), GABAARs z mutacją punktową czyniącą je niewrażliwymi na BZ, wskazując, że może nie być klasycznym czynnikiem naśladującym BZ (Rye i in., 2012). Tożsamość tego CSF PAM i jego rola w patofizjologii hipersomnii pozostają nieznane.