RuBisCO

RuBisCO is een van de vele enzymen in de Calvijn-cyclus. Wanneer Rubisco de aanval van CO2 op de C2-koolstof van RuBP en de daaropvolgende bindingsplitsing tussen de C3- en C2-koolstof vergemakkelijkt, worden 2 moleculen glyceraat-3-fosfaat gevormd. De omzetting omvat de volgende stappen: enolisatie, carboxylering, hydratatie, C-C bindingsplitsing, en protonering.

SubstratenEdit

Substraten voor RuBisCO zijn ribulose-1,5-bisfosfaat en kooldioxide (te onderscheiden van het “activerende” kooldioxide). RuBisCO katalyseert ook een reactie van ribulose-1,5-bisfosfaat en moleculaire zuurstof (O
2) in plaats van koolstofdioxide (CO
2).Het onderscheid tussen de substraten CO2 en O2 wordt toegeschreven aan de verschillende interacties van de quadrupole momenten van het substraat en een hoge elektrostatische veldgradiënt. Deze gradiënt wordt tot stand gebracht door de dimervorm van het minimaal actieve RuBisCO, dat met zijn twee componenten een combinatie van tegengesteld geladen domeinen biedt die nodig zijn voor de interactie van het enzym met O2 en CO
2. Deze omstandigheden helpen de lage omloopsnelheid van RuBisCO te verklaren: om de sterkte van het elektrische veld te vergroten dat nodig is voor voldoende interactie met de quadrupoolmomenten van de substraten, moeten de C- en N-eindsegmenten van het enzym worden afgesloten, waardoor de actieve site kan worden geïsoleerd van het oplosmiddel en de diëlektrische constante kan worden verlaagd. Deze isolatie heeft een aanzienlijke entropische kostprijs, en resulteert in de lage omloopsnelheid.

Binding RuBPEdit

Carbamylering van de ε-amino groep van Lys201 wordt gestabiliseerd door coördinatie met het Mg2+. Bij deze reactie binden de carboxylaat-termini van Asp203 en Glu204 zich aan het Mg2+ ion. Het substraat RuBP bindt Mg2+ en verdringt twee van de drie aquo-liganden.

EnolisatieEdit

Enolisatie van RuBP is de omzetting van het keto-tautomeer van RuBP in een enediol(atje). Enolisatie wordt geïnitieerd door deprotonatie bij C3. Over de enzymbasis in deze stap is gediscussieerd, maar de sterische beperkingen die in kristalstructuren zijn waargenomen, hebben Lys201 tot de meest waarschijnlijke kandidaat gemaakt. Met name de carbamaatzuurstof op Lys201 die niet gecoördineerd is met het Mg-ion deprotoneert de C3 koolstof van RuBP om een 2,3-enediolaat te vormen.

CarboxyleringEdit

Carboxylering van het 2,3-enediolaat resulteert in het intermediaire 3-keto-2′-carboxyarabinitol-1,5-bisfosfaat en Lys334 is gepositioneerd om de toevoeging van het CO2-substraat te vergemakkelijken aangezien het het derde Mg2+-gecoördineerde watermolecuul vervangt en direct aan het enediol toevoegt. Bij dit proces wordt geen Michaelis-complex gevormd. Hydratatie van deze keton resulteert in een extra hydroxigroep op C3, waardoor een gem-diol intermediair wordt gevormd. Carboxylering en hydratatie zijn voorgesteld als een enkele gecoördineerde stap of als twee opeenvolgende stappen. Het gecoördineerde mechanisme wordt ondersteund door de nabijheid van het watermolecuul bij C3 van RuBP in meerdere kristalstructuren. Binnen de spinaziestructuur zijn andere residuen goed geplaatst om te helpen bij de hydratatiestap, omdat ze binnen waterstofbrugafstand van het watermolecuul liggen.

C-C bindingsplitsingEdit

Het gem-diol intermediair splijt bij de C2-C3 binding om één molecuul glyceraat-3-fosfaat en een negatief geladen carboxylaat te vormen. Stereospecifieke protonering van C2 van dit carbanion resulteert in nog een molecuul glyceraat-3-fosfaat. Deze stap wordt vermoedelijk gefaciliteerd door Lys175 of mogelijk de gecarbamyleerde Lys201.

ProductenEdit

Wanneer kooldioxide het substraat is, is het product van de carboxylase reactie een onstabiel zes-koolstof gefosforyleerd tussenproduct bekend als 3-keto-2-carboxyarabinitol-1,5-bisfosfaat, dat snel vervalt in twee moleculen van glyceraat-3-fosfaat. Het 3-fosfoglyceraat kan worden gebruikt voor de productie van grotere moleculen zoals glucose.

Rubisco nevenactiviteiten kunnen leiden tot nutteloze of remmende bijproducten; één zo’n product is xylulose-1,5-bisfosfaat, dat de Rubisco-activiteit remt.

Wanneer moleculaire zuurstof het substraat is, zijn de producten van de oxygenase-reactie fosfoglycolaat en 3-fosfoglyceraat. Fosfoglycolaat wordt gerecycleerd door een reeks reacties die fotorespiratie wordt genoemd, waarbij enzymen en cytochromen betrokken zijn die zich in de mitochondria en peroxisomen bevinden (dit is een geval van metabolietreparatie). Bij dit proces worden twee moleculen fosfoglycolaat omgezet in één molecuul kooldioxide en één molecuul 3-fosfoglyceraat, dat opnieuw in de Calvijn-cyclus kan worden opgenomen. Een deel van het fosfoglycolaat dat deze route ingaat, kan door planten worden bewaard om andere moleculen te produceren, zoals glycine. Bij een omgevingstemperatuur van kooldioxide en zuurstof is de verhouding tussen de reacties ongeveer 4:1, wat resulteert in een netto kooldioxidebinding van slechts 3,5. Het onvermogen van het enzym om de reactie met zuurstof te voorkomen, vermindert het fotosynthesevermogen van veel planten dus aanzienlijk. Sommige planten, veel algen en fotosynthetische bacteriën hebben deze beperking overwonnen door middelen te bedenken om de concentratie kooldioxide rond het enzym te verhogen, waaronder C4-koolstoffixatie, crassulaceenzuurmetabolisme, en het gebruik van pyrenoïde.

Snelheid van enzymatische activiteitEdit

Sommige enzymen kunnen duizenden chemische reacties per seconde uitvoeren. RuBisCO is echter traag en fixeert slechts 3-10 kooldioxidemoleculen per seconde per enzymmolecuul. De reactie die door RuBisCO wordt gekatalyseerd, is dus de belangrijkste snelheidsbeperkende factor van de Calvijncyclus overdag. Niettemin reageert de snelheid van RuBisCO onder de meeste omstandigheden, en wanneer het licht niet anderszins de fotosynthese beperkt, positief op een toenemende kooldioxideconcentratie.

RuBisCO is gewoonlijk alleen overdag actief, omdat ribulose 1,5-bisfosfaat in het donker niet wordt geregenereerd. Dit is te wijten aan de regulatie van verschillende andere enzymen in de Calvin-cyclus. Bovendien wordt de activiteit van RuBisCO op verschillende andere manieren gecoördineerd met die van de andere enzymen van de Calvijn-cyclus:

Door ionenEdit

Bij belichting van de chloroplasten stijgt de pH van het stroma van 7,0 naar 8,0 vanwege de proton (waterstofion, H+
) gradiënt die over het thylakoïdmembraan ontstaat. De beweging van protonen in thylakoïden wordt aangedreven door licht en is fundamenteel voor de ATP-synthese in chloroplasten (Meer lezen: Fotosynthetisch reactiecentrum; Licht-afhankelijke reacties). Om de ionenpotentiaal over het membraan in evenwicht te brengen, bewegen magnesiumionen (Mg2+
) als reactie uit de thylakoïden, waardoor de magnesiumconcentratie in het stroma van de chloroplasten toeneemt. RuBisCO heeft een hoge optimale pH (kan >9,0 zijn, afhankelijk van de magnesiumionenconcentratie) en wordt dus “geactiveerd” door de introductie van kooldioxide en magnesium op de actieve sites, zoals hierboven beschreven.

Door RuBisCO activaseEdit

In planten en sommige algen is een ander enzym, RuBisCO activase (Rca, GO:0046863, P10896), nodig om de snelle vorming van het kritische carbamaat in de actieve site van RuBisCO mogelijk te maken. Dit is nodig omdat ribulose 1,5-bisfosfaat (RuBP) sterker bindt aan de actieve sites van RuBisCO wanneer een overmaat aan carbamaat aanwezig is, waardoor de processen niet kunnen doorgaan. In het licht bevordert RuBisCO-activase het vrijkomen van het remmende (of – in sommige opvattingen – opslag-) RuBP uit de katalytische sites van RuBisCO. Activase is ook nodig in sommige planten (b.v. tabak en veel bonen) omdat RuBisCO in het donker wordt geremd (of beschermd tegen hydrolyse) door een concurrerende remmer die door deze planten wordt gesynthetiseerd, een substraatanaloog 2-Carboxy-D-arabitinol 1-fosfaat (CA1P). CA1P bindt zich stevig aan de actieve site van gecarbamyleerde RuBisCO en remt de katalytische activiteit in nog sterkere mate. Er is ook aangetoond dat CA1P RuBisCO in een conformatie houdt die beschermd is tegen proteolyse. In het licht bevordert RuBisCO-activase ook het vrijkomen van CA1P uit de katalytische sites. Nadat het CA1P uit RuBisCO is vrijgekomen, wordt het snel omgezet in een niet-remmende vorm door een door licht geactiveerd CA1P-phosphatase. Zelfs zonder deze sterke remmers worden eens in de paar honderd reacties de normale reacties met kooldioxide of zuurstof niet voltooid; er worden nog andere remmende substraatanalogen gevormd in de actieve site. Opnieuw kan RuBisCO-activase het vrijkomen van deze analogen uit de katalytische sites bevorderen en het enzym in een katalytisch actieve vorm houden. Bij hoge temperaturen aggregeert RuBisCO-activase echter en kan het RuBisCO niet langer activeren. Dit draagt bij tot de verminderde carboxylerende capaciteit die tijdens hittestress wordt waargenomen.

Door ATP/ADP en stromale reductie/oxidatietoestand door het activaseEdit

De verwijdering van het remmende RuBP, CA1P, en de andere remmende substraatanalogen door activase vereist de consumptie van ATP. Deze reactie wordt geremd door de aanwezigheid van ADP, en de activiteit van activase hangt dus af van de verhouding van deze verbindingen in het chloroplast stroma. Bovendien wordt in de meeste planten de gevoeligheid van activase voor de verhouding ATP/ADP gewijzigd door de stromale reductie/oxidatie (redox) toestand via een ander klein regulerend eiwit, thioredoxine. Op deze wijze kunnen de activiteit van activase en de activeringstoestand van RuBisCO worden gemoduleerd in reactie op de lichtintensiteit en daarmee de snelheid van vorming van het ribulose 1,5-bisfosfaat substraat.

Door fosfaatEdit

In cyanobacteriën neemt ook anorganisch fosfaat (Pi) deel aan de gecoördineerde regulering van de fotosynthese: Pi bindt zich aan de actieve plaats van RuBisCO en aan een andere plaats op de grote keten, waar het de overgangen tussen geactiveerde en minder actieve conformaties van het enzym kan beïnvloeden. Op deze manier zou de activering van bacteriële RuBisCO bijzonder gevoelig kunnen zijn voor Pi-niveaus, waardoor het op een vergelijkbare manier zou kunnen werken als hoe RuBisCO-activase functioneert in hogere planten.

Door kooldioxideEdit

Omdat kooldioxide en zuurstof concurreren op de actieve plaats van RuBisCO, kan de koolstoffixatie door RuBisCO worden verbeterd door het kooldioxideniveau te verhogen in het compartiment dat RuBisCO bevat (chloroplast stroma). Tijdens de evolutie van planten zijn er verschillende mechanismen ontwikkeld om het kooldioxidegehalte in het stroma te verhogen (zie C4-koolstoffixatie). Het gebruik van zuurstof als substraat lijkt een raadselachtig proces, aangezien het de gevangen energie lijkt weg te gooien. Het kan echter een mechanisme zijn om overbelasting van koolhydraten tijdens perioden van hoge lichtflux te voorkomen. Deze zwakte in het enzym is de oorzaak van fotorespiratie, zodat gezonde bladeren in fel licht netto geen koolstoffixatie hebben wanneer de verhouding tussen O
2 en CO
2 beschikbaar voor RuBisCO te ver verschuift in de richting van zuurstof. Dit fenomeen is vooral temperatuurafhankelijk: Hoge temperaturen kunnen de concentratie van CO
2 opgelost in het vocht van bladweefsels verlagen. Dit fenomeen houdt ook verband met waterstress: Aangezien plantenbladeren verdampingsgekoeld worden, veroorzaakt een beperkte hoeveelheid water hoge bladtemperaturen. C4-planten gebruiken aanvankelijk het enzym PEP-carboxylase, dat een hogere affiniteit heeft voor CO
2. Het proces maakt eerst een 4-koolstof tussenproduct, dat naar een plaats van C3-fotosynthese wordt gependeld en vervolgens wordt gede-carboxyleerd, waarbij CO
2 vrijkomt om de concentratie CO
2 te verhogen, vandaar de naam C4-planten.

Crassulaceenzuurmetabolisme (CAM) planten houden hun huidmondjes overdag gesloten, wat water bespaart, maar voorkomt dat de lichtonafhankelijke reacties (alias de Calvijncyclus) plaatsvinden, aangezien deze reacties CO
2 vereisen om via gasuitwisseling door deze openingen te passeren. Verdamping via de bovenzijde van een blad wordt voorkomen door een waslaag.