Results and Discussion
VARV Genome Stability and Phylogenetic Analysis.
De beschikbaarheid van genoomsequenties van een verzameling VARV-isolaten met een brede geografische spreiding (Fig. 1) werd gebruikt voor de evolutionaire studie van VARV (4). VARV, een lid van het genus Orthopoxvirus, bevat een enkelvoudig lineair dubbelstrengs DNA-genoom van 186 kb dat codeert voor de meeste enzymen voor zijn vermeerdering (5). De bestudeerde VARV-isolaten vertoonden een lage mutatiegraad omdat epidemiologisch gekoppelde isolaten weinig of geen sequentieveranderingen vertoonden in monsters met een tijdsverschil tot 1 jaar. Deze lage mutatiegraad is duidelijk te zien bij onze genetisch identieke monsters uit Bangladesh die tussen 1974 en 1975 zijn verzameld. Deze monsters vertegenwoordigen ongetwijfeld lange complexe transmissieketens uit een van de dichtstbevolkte gebieden ter wereld, maar hebben identieke of bijna identieke nucleotide-sequenties. Het verwante orthopoxvirus monkeypoxvirus vertoont op soortgelijke wijze enkele of geen nucleotideveranderingen tussen isolaten van drie verschillende gastheren bij een recente uitbraak in de Verenigde Staten (6). Binnen en tussen soorten orthopoxvirussen bezitten de genomen nucleotide-identiteiten van >99,6% tussen VARV-isolaten en 98% tussen VARV en congenerische taxa zoals taterapoxvirus (TATV) (4) (West-Afrika) en camelpoxvirus (CMLV) (7) (Centraal-Azië) (Tabel 1), twee soorten met de hoogste sequentie-identiteit met VARV (4). Door de grote omvang en de trage nucleotide-substitutiesnelheid kan het genomisch DNA van de VARV fylogenetisch informatieve mutaties behouden, terwijl er minder homoplastische mutaties voorkomen (d.w.z. minder omkeringen van de karaktertoestand). De diversiteit van 47 recent gesequenteerde VARV-genomen was grotendeels geassocieerd met de geografische oorsprong van de isolaten (ref. 4 en deze studie), en mutaties hadden een minimale associatie met temporele variatie tussen isolaten. Deze observaties tonen aan dat er niet één enkele pandemische stam was ( SI Text , Noot 1) maar eerder dat de genetische clades van deze analyses representatief zijn voor oude en misschien oude lokaal endemische stammen.
Hypothesen over de oorsprong van VARV. Gebeurtenis 0: De grote gelijkenis van VARV met de genoomsequenties van CMLV en TATV suggereert dat TATV en CMLV een recentere gemeenschappelijke voorouder hebben met VARV dan andere bekende orthopoxvirussoorten. Gebeurtenis 1, hypothese A: Een voorouderlijke VARV divergeerde in twee primaire clades (P-I en P-II) en evolueerde onafhankelijk in de Oude Wereld en de Nieuwe Wereld door zijn menselijke gastheren te volgen. Gebeurtenis 1, hypothese B: De divergentie van P-I/P-II in Afrika. Gebeurtenis 2, hypothesen A en B: De lange enkele tak en de daaropvolgende radiatie van P-I suggereren dat de voorouderlijke VARV van P-I waarschijnlijk in Noordoost-Azië is ontstaan en dat de pokken-endemieën van P-I zich begonnen te verspreiden naar Oost-Azië, het Midden-Oosten en India toen de lokale populaties voldoende groot werden. Gebeurtenis 2a: De diversificatie en migratie van P-I door heel Azië. Gebeurtenis 2b, Westerse exploratie bracht VARV major naar Zuid-Afrika vanaf het Indiase subcontinent, dat zich vervolgens noordwaarts verspreidde naar Centraal Afrika en de Hoorn van Afrika (Somalisch schiereiland). Gebeurtenissen 3 en 4, hypothese A: De diversificatie van P-II in de Nieuwe Wereld gevolgd door de herintroductie in Afrika; hypothese B: De diversificatie van P-II in Afrika, gevolgd door de latere introductie van één subclade in de Nieuwe Wereld.
Als de P-I straling de endemische pokkengeschiedenis in de Oude Wereld vertegenwoordigt, verklaart dit het historische raadsel betreffende de afwezigheid van een beschrijving van pokken in de literatuur van de oude Griekse en Romeinse beschavingen (1). Het is waarschijnlijk dat de pokkenepidemieën in deze regio later plaatsvonden dan die in het oude China en India. De “plaag van Athene” in 430 v. Chr. die Thucydides beschreef en die vroeger als pokken werd beschouwd (3), zou deze theorie tegenspreken, maar onlangs is vastgesteld dat het om tyfus ging (25). Tijdens de regering van Ramses V bevond Egypte zich in een burgeroorlog en werd het aangevallen door vijanden uit het noorden (3); als de puistige uitbarsting van Ramses V het gevolg was van pokken, zou het kunnen gaan om een pokkenuitbarsting van geïmporteerde gevallen vanwege de oorlog in plaats van een regionale endemische ziekte. Deze hypothese wordt ondersteund door het feit dat slechts drie mummies uit die periode soortgelijke laesies hadden (2).
Diversificatie van Alastrim minor.
De op pokkengeschiedenis/VARV-topologie gebaseerde analyses tonen aan dat de divergentie van alastrim minor en West-Afrikaanse variola minstens 800 jaar geleden begon (Tabel 2 en SI Tabel 4), voorafgaand aan de eerdere hypothese dat deze divergentie samenviel met het begin van de slavenhandel. Volgens de meer oude oorsprongshypothese zou deze divergentie kunnen zijn opgetreden na een speciatiegebeurtenis in ofwel de Nieuwe Wereld (gebaseerd op de ijking van de vroegste historische pokkenregistraties; Fig. 3 A) of West-Afrika (gebaseerd op de ijking van de Zuid-Afrikaanse historische pokkenregistraties; Fig. 3 B). Deze scenario’s zouden suggereren dat er ongeïdentificeerde variola minor/alastrim isolaten bestonden in Afrika of de Nieuwe Wereld veel eerder dan de ontdekking van alastrim minor (P-II); dit taxon heeft dus een langere geschiedenis dan tot nu toe is beschreven.
Hoewel de goed gedocumenteerde import van VARV major in de Amerika’s een verwoestend effect had op veel van de inheemse populaties (2), kunnen de gegevens over de snelle verspreiding van de ziekte met een grote sterfte, gedeeltelijk worden toegeschreven aan het gecombineerde effect van de hoge bevolkingsdichtheid, het gebrek aan basiszorg voor de slachtoffers, en mogelijke co-infecties met andere ziekten uit de Oude Wereld (26, 27). Historisch gezien zijn er weinig gegevens over pokken in West-Afrika, en Henige (28) beweerde dat de eerste grote pokkenuitbraak in de Nieuwe Wereld niet afkomstig was uit West-Afrika, wat de hypothese van een vroege pokkengeschiedenis in West-Afrika zou weerleggen. Het is mogelijk dat alastrim zich na een oude introductie onafhankelijk heeft ontwikkeld in geïsoleerde regio’s binnen het grote geografische gebied van de Nieuwe Wereld. In feite toonde de studie van Phelan aan dat de inheemse populaties van de hooglanden van Ecuador niet afnamen tijdens de aanvankelijke Spaanse overheersing (waarvan wordt toegeschreven dat zij VARV major in de Nieuwe Wereld hebben geïntroduceerd) (29), wat suggereert dat deze populaties meer resistent zouden kunnen zijn geweest tegen pokken, misschien door eerder contact met alastrim. In Trinidad werd een milde pokkenuitbraak in 1902 gedocumenteerd als afkomstig uit deze regio (30). Als deze diversificatie plaatsvond in de Nieuwe Wereld, dan zou de primaire isolatie waarschijnlijk het gevolg zijn van de verplaatsing van een voorouderlijk VARV met vroege mensen naar die regio (Fig. 4A). De afwezigheid van SNP signaturen die wijzen op vermenging tussen P-I en P-II (SI Figs. 6 en 7), de consistente en significant verschillende klinische kenmerken van alastrim van traditionele VARV major van P-I (31), zouden verklaard kunnen worden door zo’n significante geografische scheiding.
Als de splitsing van P-I/P-II plaatsvond binnen de Oude Wereld, is P-II waarschijnlijk ontstaan in West-Afrika. De twee P-II subclades zouden dan ≈800-1.100 YBP (Tabel 2 en SI Tabel 4) op het Afrikaanse continent gedivergeerd zijn. De geografische spreiding van deze gebeurtenissen is moeilijk te bepalen door een gebrek aan geschreven geschiedenis in deze regio’s. De aanwezigheid en diversificatie van andere nauw verwante orthopoxvirussen zoals monkeypox en TATV zou echter een Afrikaanse oorsprong voor voorouderlijke VARVs kunnen ondersteunen. Als de isolatie en diversificatie van P-II plaatsvond in Afrika, dan is er, gebaseerd op onze fylogenie, een onbeschreven Afrikaanse vertegenwoordiger van de P-II subgroep, die misschien honderden jaren na de diversificatie in de Nieuwe Wereld werd geïntroduceerd, mogelijk gedurende de tijd van de slavenhandel tussen landen in de Oude en Nieuwe Wereld (Fig.
Een gebrekkig begrip van de geschiedenis van deze culturen en de relatief mildere klinische symptomen (vergeleken met variola major) dragen bij tot het ontbreken van een uitgebreider historisch verslag van pokkenziekte(n) in de Nieuwe Wereld of in Afrika ten zuiden van de Sahara. De historische bevolkingsdichtheid in deze beide gebieden was lager dan in de gebieden met endemische variola major. In gevallen van een mildere ziekte zouden de individuen mobieler zijn geweest wanneer zij besmettelijk waren en zouden zij een groter aantal contacten hebben gehad en aldus de verspreiding van de ziekte hebben bestendigd. Ter ondersteuning van deze hypothese, bleven de milde pokkenuitbraken in Somalië gedurende lange perioden voortduren onder kleine nomadische groepen en vertoonden zij een significant verschillend overdrachtspatroon vergeleken met dat van VARV major (2). Hoewel het onbekend is of de inheemse volkeren van Afrika of Amerika de praktijk van variolatie/inenting toepasten, zou de lange levensduur van VARV in herstellende korsten (tot een decennium) (32-34) een ander mechanisme verschaffen voor de herhaalde introductie van een pokkenstam binnen een geografische gemeenschap, hetzij door onopzettelijk contact met korstmateriaal, hetzij rechtstreeks door variolatiepraktijken.
Oorsprong van VARV.
Mogelijke aanwijzingen betreffende de aanpassing van VARV aan de mens kunnen gevonden worden in de nauwe verwantschap tussen VARV en TATV/CMLV (4). TATV wordt geassocieerd met een terrestrisch knaagdier afkomstig uit West-Afrika (35). Onze coalescentie-analyses geven aan dat de divergentie tussen VARV en TATV plaatsvond tussen 16.000 YBP (Tabel 2 en SI Dataset 4, gebaseerd op de historische pokkenregistraties van Zuid-Afrika) en 68.000 YBP (Tabel 2 en SI Dataset 3, gebaseerd op de vroegst geregistreerde pokkengeschiedenis in Oost-Azië). Dus, net als de verwante zoönotische orthopoxvirussen met knaagdierreservoirs (6, 36, 37), kan VARV geëvolueerd zijn uit een enzoötische ziekteverwekker van Afrikaanse knaagdieren en zich vervolgens buiten Afrika verspreid hebben.
De genomische sequenties van VARV-isolaten die voor deze studie geselecteerd werden, werden genomen uit de World Health Organization Collaborating Center repository en, hoewel ze een laag niveau van sequentie-divergentie vertonen, zijn ze representatief voor de grootste geografische en temporele diversiteit binnen de collectie. De van cSNP’s afgeleide fylogenie van deze isolaten levert een topologie op die consistent is met historische menselijke migratiepatronen, bevolkingsexpansie en gedocumenteerde pokkenepidemieën. De afgebeelde topologie ondersteunt de hypothese (Fig. 3) dat twee variola-clades divergeerden van een voorouderlijk virus en vervolgens evolueerden in geografisch gescheiden menselijke populaties. Hoewel de reden voor de verschillende menselijke pathogenese van alastrim en VARV major onduidelijk is, voegen de genetische structuur van alastrim minor en zijn topologie met de andere VARV-isolaten cruciale stukjes toe aan de pokkenevolutiepuzzel. Deze voorgestelde fylogenie van VARV verlengt de evolutionaire tijd van pokken in vergelijking met die van vorige theorieën.