High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is een vorm van kolomchromatografie waarbij een monstermengsel of analyt in een oplosmiddel (de zogenaamde mobiele fase) onder hoge druk door een kolom met chromatografisch pakkingsmateriaal (stationaire fase) wordt gepompt. Het monster wordt vervoerd door een bewegende draaggasstroom van helium of stikstof. HPLC kan verbindingen scheiden en identificeren die aanwezig zijn in elk monster dat in een vloeistof kan worden opgelost, in sporenconcentraties zo laag als delen per triljoen. Vanwege deze veelzijdigheid wordt HPLC gebruikt in een verscheidenheid van industriële en wetenschappelijke toepassingen, zoals farmaceutische, milieu-, forensische en chemische toepassingen.
De retentietijd van het monster varieert afhankelijk van de interactie tussen de stationaire fase, de moleculen die worden geanalyseerd en het gebruikte oplosmiddel of de gebruikte oplosmiddelen. Wanneer het monster door de kolom passeert, is er een verschillende interactie tussen de twee fasen, voornamelijk als gevolg van verschillende polariteiten in de analyten. Analyten die de minste interactie met de stationaire fase of de meeste interactie met de mobiele fase hebben, verlaten de kolom sneller.
Instrumentatie:
De belangrijkste onderdelen van een HPLC-systeem zijn het oplosmiddelreservoir, of meerdere reservoirs, een hogedrukpomp, een kolom, een injectorsysteem en de detector.
Detectiegrens |
Gas aanbeveling |
Regulator aanbeveling |
| Purge gas | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 series |
Het reservoir bevat het oplosmiddel, dat de mobiele fase wordt genoemd omdat het beweegt. Meestal zijn er ten minste twee reservoirs in een systeem, elk met maximaal 1000 cc oplosmiddel en meestal voorzien van een gasdiffusor waardoor helium kan borrelen. Een pomp wordt gebruikt om een gespecificeerde stroom van de mobiele fase te genereren. Hoewel handmatige injectie van monsters nog steeds mogelijk is, zijn de meeste HPLC’s thans volledig geautomatiseerd en worden zij door een computer gestuurd. De injector, of autosampler, brengt het oplosmiddel in een fasestroom die het monster naar de hogedrukkolom (tot 400 bar) voert, die specifiek pakkingsmateriaal bevat dat nodig is voor de scheiding. Het pakkingsmateriaal wordt de stationaire fase genoemd, omdat het op zijn plaats wordt gehouden door de kolomhardware.
Een detector is nodig om de gescheiden verbindingen te zien wanneer zij uit de hogedrukkolom elueren. De informatie wordt van de detector naar een computer gezonden die het chromatogram genereert. De mobiele fase verlaat de detector en wordt naar keuze naar de afvalbak afgevoerd of opgevangen.
Heliumsparging is een doeltreffende methode om de mobiele fase te ontgassen ter vermijding van onstabiele basislijnen veroorzaakt door opgeloste lucht. Stikstof wordt gebruikt als vernevelingsgas in de verdampingslichtverstrooiingsdetector (ELSD), waarbij het oplosmiddel uit het monster wordt verdampt en een nevel achterblijft die wordt gemeten.
High-Performance Liquid Chromatography – Other HPLC Types
Ultra High Performance Liquid Chromatography (uHPLC):
Waar standaard HPLC gewoonlijk gebruik maakt van kolomdeeltjes met een grootte van 3 tot 5µm en een druk van ongeveer 400 bar, maakt uHPLC gebruik van speciaal ontworpen kolommen met deeltjes tot een grootte van 1,7µm, bij een druk van meer dan 1000 bar. Het belangrijkste voordeel van een uHPLC is snelheid. Deze systemen zijn sneller, gevoeliger en hebben kleinere volumes organische oplosmiddelen nodig dan standaard-HPLC, zodat meer monsters in minder tijd kunnen worden verwerkt. Als de systemen echter bij een typische druk van meer dan 800 bar worden gebruikt, verouderen de kolommen of worden zij sneller afgebroken. Er wordt gewerkt aan nieuwere technologie voor uHPLC-eenheden om kolomdeeltjes met een grootte van 1 µm en drukpotentiëlen tot 6.800 bar te gebruiken.
uHPLC is ook bekend onder de naam UPLCTM, een handelsmerk van de Waters Corporation.
Snelle proteïnevloeistofchromatografie (FPLC):
FPLC is een systeem dat lijkt op hogedrukvloeistofchromatografie en dat wordt gebruikt om eiwitten en andere biomoleculen van complexe mengsels te scheiden of te zuiveren. Het belangrijkste verschil tussen FPLC en HPLC is de standaardwerkdruk. FPLC-kolommen kunnen slechts worden gebruikt tot een maximale druk van 3-5 MPa. Als de druk van de HPLC kan worden beperkt, kan bijna elke FPLC-kolom ook in een HPLC-systeem worden gebruikt.