Dose and Time Effects of Caffeine Intake on Human Platelet Adenosine A2A Receptors

Caffeïne, gevonden in verschillende bronnen zoals koffie, thee, chocolade, en cola dranken, is de meest verspreide actieve stof in de wereld. De gemiddelde cafeïneconsumptie door volwassen mensen varieert tussen verschillende culturen en naties van 80 tot 400 mg per persoon per dag.1 Cafeïne lokt een groot aantal farmacologische reacties uit, waaronder verhoogde waakzaamheid, verminderde psychomotorische reactietijd, en verhoogde slaaplatentie en waaktijd, en kan ook intellectuele prestaties beïnvloeden.2 Bovendien veroorzaakt cafeïne ontspanning van gladde spieren, verhoogt het de uitscheiding van maagzuur en de afgifte van catecholamines, en verhoogt het de stofwisselingsactiviteit.3

Het precieze mechanisme dat ten grondslag ligt aan de werking van cafeïne blijft slecht gedefinieerd. Hoewel de remming van fosfodiësterases kan bijdragen aan de werking van cafeïne,4 zijn er steeds meer aanwijzingen dat de meeste farmacologische effecten van dit xanthine het gevolg zijn van antagonisme van adenosinereceptoren, aangeduid als A1, A2A, A2B, en A3 subtypes.5 Cafeïne werkt het krachtigst op A2A-receptoren, op de voet gevolgd door A1-receptoren, dan A2B-receptoren,6 en als een zwakke antagonist op menselijke A3-receptoren. Blokkade door cafeïne van adenosinereceptoren, namelijk de A1 en A2A receptortypes, remt de werking van endogene adenosine op een verscheidenheid van fysiologische processen.7 Onder normale omstandigheden blijken bloedniveaus van adenosine voldoende te zijn om A2A receptoren in bloedplaatjes tonisch te activeren. Onlangs werd bij A2A receptor-knockout muizen gerapporteerd dat de aggregatie van bloedplaatjes toenam, wat wijst op het belang van dit receptor-subtype voor de functie van bloedplaatjes.8 Het is daarom denkbaar dat cafeïne deze tonisch geactiveerde A2A-receptoren in bloedplaatjes blokkeert en hun door adenosine gemoduleerde functies verandert.

Jarenlang werd een verband vermoed tussen koffiedrinken en hart- en vaatziekten, in het bijzonder coronaire hartziekten,9 maar onlangs is aangetoond dat koffie- of cafeïneconsumptie het risico op coronaire hartziekten of beroerte niet verhoogt.1011 Talrijke epidemiologische studies naar myocardinfarcten hebben geen nadelig effect gevonden van <5 kopjes koffie per dag, terwijl de resultaten bij hogere innameniveaus controversieel zijn.12 Bij patiënten met hypertensie werd geen nadelig uitkomstrisico waargenomen bij elk niveau van cafeïne-inname.13

In een studie van Biaggioni et al14 werd gevonden dat een herhaald doseringsschema van cafeïne leidt tot significante veranderingen in de functionele respons van menselijke bloedplaatjes op de adenosinereceptoragonist 5′-N-ethylcarboxamidoadenosine (NECA). Cafeïne-onttrekking veroorzaakte een significante linkswaartse verschuiving van de NECA-geïnduceerde remming van aggregatie.14 In overeenstemming hiermee hebben we onlangs aangetoond,15 bij proefpersonen die gedurende 1 week met 750 mg/d werden behandeld, dat chronische inname van cafeïne de aggregatie van bloedplaatjes verandert als gevolg van de upregulatie van de A2A-receptoren die zich op het oppervlak van de bloedplaatjes bevinden.

In het huidige artikel leveren we verder bewijs dat een soortgelijke respons wordt gevonden bij proefpersonen die worden behandeld met cafeïne in verschillende doses, zoals 600 mg/d gedurende 1 week of 400 mg/d, toegediend gedurende een langere periode, zoals 2 weken. In de huidige studie werd dit gedaan door het direct meten van adenosine A2A receptor veranderingen (dichtheid en affiniteit) en hun functie door het bepalen van het effect van de A2A selectieve agonist 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) om (1) cAMP accumulatie te verhogen, (2) bloedplaatjes aggregatie te remmen, en (3) intracellulaire calcium niveaus te verlagen. Na chronisch gebruik (600 mg/d gedurende 1 week of 400 mg/d gedurende 2 weken) werd een upregulatie van de adenosine A2A receptoren van bloedplaatjes gevonden, die sterk gecorreleerd was met anti-aggregatoire effecten, een toename van de cAMP accumulatie, en een afname van het intracellulaire calciumgehalte. Er werden geen verschillen gevonden in binding en functionele parameters bij proefpersonen die gedurende 1 week met 400 mg/d werden behandeld.

Methoden

Vijfenveertig gezonde, niet-rokende proefpersonen, 25 tot 45 jaar oud, van beide geslachten, werden onderzocht. Na schriftelijke toestemming werd de proefpersonen gevraagd om zich gedurende ≥2 weken te onthouden van methylxanthines in de voeding. Ze werden verdeeld in 3 groepen (15 personen elk) volgens het cafeïne toedieningsschema (dat wil zeggen, dosis en duur van de toediening): 200 mg oraal 2 keer per dag voor een periode van 7 dagen (groep 1); 200 mg oraal 2 keer per dag voor een periode van 14 dagen (groep 2); en 200 mg oraal 3 keer per dag voor een periode van 7 dagen (groep 3). Bloedplaatjes van deze proefpersonen werden onderzocht voordat zij met cafeïne begonnen (dag 0) en op 1, 12, 60, en 108 uur na de laatste dosis cafeïne. Met name het tijdstip van 1 uur werd alleen bestudeerd in de groep die de maximale dosis cafeïne (600 mg/d) had gekregen. EC50 en IC50 in functionele assays konden niet op 1 uur worden verkregen vanwege de praktische problemen in verband met het overmatig afnemen van bloed in een beperkte periode (1 tot 12 uur).

SCH 58261 Binding Assay in Human Platelet Membranes

Membranen van menselijke bloedplaatjes werden bereid zoals eerder beschreven16 en gebruikt voor radioligandbindingstests met SCH 58261 volgens Varani et al.17 In verzadigingsstudies werden menselijke bloedplaatjesmembranen geïncubeerd met 8 tot 10 verschillende concentraties van SCH 58261, variërend van 0,01 tot 10 nmol/L. De niet-specifieke binding werd bepaald in aanwezigheid van NECA 10 μmol/L. Na 60 minuten incubatie bij 4 °C werden de monsters gefiltreerd door Whatman GF/B-filters met een Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Een gewogen niet-lineaire kleinste kwadraten curve-fitting programma, LIGAND,18 werd gebruikt voor computeranalyse van de gegevens van de verzadiging experiments.

Meting van cAMP niveaus in menselijke bloedplaatjes

Wassen menselijke bloedplaatjes verkregen uit het perifere bloed van gezonde vrijwilligers werden bereid zoals eerder beschreven.16 Bloedplaatjes (6×104 tot 8×104 cellen) werden geïncubeerd met 1,0 U adenosine deaminase/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidazolidinon (Ro 20-1724) als fosfodiësteraseremmer, en 6 tot 8 verschillende concentraties HE-NECA. EC50-waarden werden verkregen uit concentratie-respons curven na log-logit transformatie van afhankelijke variabelen door een gewogen kleinste-kwadraten methode.19 De uiteindelijke waterige oplossing werd getest op cAMP niveaus door een competitie eiwitbindingstest.15

Platelet Aggregation Assay

Gecitreerd menselijk bloed werd gecentrifugeerd bij 200g gedurende 10 minuten om bloedplaatjes-rijk plasma te verkrijgen en bij 2500g gedurende 20 minuten om bloedplaatjes-arm plasma te verkrijgen. Menselijke bloedplaatjes werden geteld in een Coulter Counter model S8/80 (Coulter Electronics Inc) en aangepast tot 2,5×108/mL tot 3,5×108/mL met autoloog bloedplaatjes-arm plasma. De aggregatie van bloedplaatjes werd uitgevoerd volgens de Born turbidimetrische techniek20 met een DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Na incubatie gedurende 3 minuten met 6 tot 8 verschillende concentraties HE-NECA werd bloedplaatjesrijk plasma geaggregeerd bij 37°C onder voortdurend roeren met ADP. Soortgelijke experimenten werden uitgevoerd met ADP in verschillende concentraties (100 nmol/L tot 100 μmol/L). Maximale aggregatie, opgenomen 5 minuten na de toevoeging van ADP, werd gebruikt voor de kwantitatieve analyse, en het percentage remming werd berekend ten opzichte van de controlewaarden.21

Cytoplasmatische vrije Ca2+-concentratiemetingen

Cytosolische vrije calciumconcentratie werd gemeten met behulp van de fura 2-techniek volgens Paul et al.22 Kort gezegd werden bloedplaatjes geïncubeerd in totale duisternis gedurende 30 minuten bij 37°C met 1 μmol/L fura 2-AM en magnetisch geroerd in fluorimeter cuvetten (LS50, Perkin Elmer, Ltd) bij een concentratie van 108/mL in de aanwezigheid van 250 μmol/L sulfinpyrazone. De intracellulaire Ca2+-concentratie (i) werd bepaald bij een excitatieverhouding van 340/380 en een emissiegolflengte van 505 nm.

Statistische analyse

Analyse van de gegevens werd uitgevoerd door 1-weg ANOVA. De analyse van de verschillen tussen de met cafeïne behandelde groepen (12, 60 en 108 uur) en de controlepersonen werd uitgevoerd met de Student’s t-test (ongepaarde analyse). Verschillen werden als significant beschouwd bij een waarde van P<0,01. Alle gegevens worden gerapporteerd als gemiddelde±SEM.

Resultaten

Plaatjes van de 3 groepen proefpersonen werden geoogst voordat met de toediening van cafeïne werd begonnen (dag 0, controle) en op 1, 12, 60, en 108 uur na de laatste dosis (cafeïne-onttrekking). De tabel geeft een overzicht van de resultaten van bindende en functionele experimenten van de 3 groepen proefpersonen.

Groep 1 (400 mg/d gedurende 1 week)

Bindingparameters onthulden een controle Bmax-waarde van 105±6 mol/mg eiwit en een KD-waarde van 1,28±0,08 nmol/L. In controleplaatjes verhoogde HE-NECA de cAMP-spiegel met een EC50 van 60±5 nmol/L en remde het (1) aggregatie met een IC50 van 86±10 nmol/L en (2) calciumspiegels met een IC50 van 104±8 nmol/L. Er werden geen statistisch significante verschillen gevonden in bindende en functionele parameters op 12, 60 en 108 uur na het stoppen met cafeïne (tabel).

Groep 2 (400 mg/d gedurende 2 weken)

Bindingparameters onthulden een controle Bmax-waarde van 110±3 fmol/mg eiwit en een KD-waarde van 1,21±0,09 nmol/L. Op 12 en 60 uur na de terugtrekking van cafeïne was de receptordichtheid, Bmax, op beide tijdstippen met ongeveer 20% toegenomen, maar de KD-waarden waren onveranderd. Functionele experimenten toonden aan dat de adenosine A2A-receptoragonist HE-NECA significant krachtiger was in het verhogen van de cAMP in de bloedplaatjes (d.w.z. de EC50-waarden waren respectievelijk 45% en 65% lager op 12 en 60 uur na het onttrekken van cafeïne dan de controlewaarden). Een soortgelijke trend werd waargenomen bij de IC50-waarden die werden verkregen bij aggregatie-experimenten en bij metingen van de cytoplasmatische vrije calciumconcentratie (tabel).

Groep 3 (600 mg/d gedurende 1 week)

Over het geheel genomen verkregen we gegevens die vergelijkbaar waren met die van groep 2. SCH 58261 bond zich aan één enkele affiniteitsklasse van plaatsen in bloedplaatjesmembranen van controles met een Bmax van 100±4 fmol/mg eiwit en een KD van 1,27±0,09 nmol/L. Zoals getoond in Figuur 1A, in membranen van bloedplaatjes geoogst op 1, 12, 60, en 108 uur na cafeïne onttrekking, het radioligand gebonden met dezelfde affiniteit, maar het aantal bindingsplaatsen (Bmax) was significant (P<0.01) verhoogd. In parallelle studies werden de functionele responsen van bloedplaatjes op de A2A receptor agonist HE-NECA bepaald. Zoals samengevat in de tabel, was de potentie van HE-NECA om (1) de vorming van cAMP te verhogen, (2) ADP-geïnduceerde aggregatie van bloedplaatjes te remmen, en (3) de calciumspiegels te verlagen significant verhoogd in bloedplaatjes verkregen op 12, 60, en 108 uur na cafeïneonttrekking (Figuur 1B, 1C, en 1D). Experimenten werden ook uitgevoerd om te bepalen of de toename van de dichtheid van A2A-receptoren gepaard zou gaan met een afname van de potentie en / of efficiëntie van ADP om aggregatie te induceren. De EC50-waarden van ADP voor het stimuleren van bloedplaatjesaggregatie bij 12, 60 en 108 uur na de terugtrekking van cafeïne waren respectievelijk 0,7±0,2, 0,9±0,1 en 0,8±0,1 μmol/L, waarden die niet significant verschilden van de 0,9±0.2 μmol/L verkregen in bloedplaatjes van controles (figuur 2).

Discussie

De effecten van langdurige toediening van cafeïne bij mens en dier en de rol ervan in hun tolerantie voor de werking van cafeïne zijn controversieel. Sommige studies toonden een toename van A1 receptoren in de hersenen van muizen en vonden bewijs voor een dosisafhankelijke upregulatie van A1 receptoren door cafeïne.23 Andere studies toonden een upregulatie van A2A receptoren, wat een adaptief effect van cafeïne inname suggereert.24 Bovendien kan chronische cafeïne consumptie leiden tot een vermindering van de aggregabiliteit van bloedplaatjes als gevolg van upregulatie van de A2A receptoren die zich op het oppervlak van de bloedplaatjes bevinden14 en een potentiële rol spelen in pathofysiologische processen, zoals aggregatie en thrombogenese. Hoewel dergelijke veranderingen kunnen bijdragen aan veranderingen in de functie van bloedplaatjes, verandert tolerantie voor cafeïne niets aan de potentie van dit xanthine als een competitieve antagonist van de effecten van adenosine.25 Andere veranderingen, zoals verschuiving van de receptoraffiniteit naar een hoge affiniteit, veranderingen in het niveau van G-eiwitten of de koppeling van deze eiwitten aan adenosinereceptoren, of langdurige receptorbezetting kunnen betrokken zijn bij het verschijnsel tolerantie.26 Ontwenningsverschijnselen van cafeïne komen voor bij mensen; typisch zijn hoofdpijn, vermoeidheid, lusteloosheid en slaperigheid.9 In het bijzonder verhoogt cafeïne de plasma-adenosineconcentratie, en de vermindering ervan na ontwenning van de antagonist suggereert receptorgemedieerde regulatie van de plasma-adenosineconcentratie.27 Tijdens ischemie en/of hypoxie heeft adenosine ook neuroprotectieve werkingen. In de volwassen hersenen vermindert chronische cafeïnebehandeling, die leidt tot upregulatie van adenosinereceptoren, ischemische schade, terwijl acute blootstelling (receptorantagonistisch effect) ischemische schade verhoogt.28

Het is aangetoond dat chronische inname van cafeïne de reactie van bloedplaatjes op de acties van adenosine verandert.14 Herhaalde toediening van cafeïne (750 mg/d gedurende 1 week) toonde een toename van de A2A receptordichtheid, gepaard gaande met sensibilisatie van de bloedplaatjesresponsen, zoals een toename van de cAMP accumulatie en een afname van de bloedplaatjesaggregatie.15 Het doel van de huidige studie was om het effect van de cafeïnedosering en van de duur van de toediening op de bindende en functionele parameters te bepalen. Daarom bestudeerden we de veranderingen in de dichtheid en affiniteit van adenosine A2A receptoren in menselijke bloedplaatjesmembranen van personen die werden behandeld met verschillende doses (400 of 600 mg/d) gedurende verschillende perioden van cafeïne-inname (1 of 2 weken). Specifiek bestudeerden we controlepersonen (vóór de toediening van cafeïne) en met cafeïne behandelde personen (1, 12, 60 en 108 uur na de laatste dosis cafeïne).

De behandeling met 400 mg/d cafeïne gedurende 1 week wijzigde de A2A-receptorbinding en functionele parameters niet. Echter, behandeling met 400 mg/d gedurende 2 weken of 600 mg/d gedurende 1 week resulteerde in (1) een significante toename (upregulatie) van adenosine A2A bindingsplaatsen, (2) een toename van cAMP accumulatie, (3) een toename van anti-aggregatoire effecten, en (4) een afname van calcium niveaus opgewekt door de A2A receptor agonist HE-NECA.

De upregulatie van A2A receptoren kan waarschijnlijk worden toegeschreven aan de synthese van nieuwe receptoren tijdens de differentiatie van voorlopercellen. Deze interpretatie is gebaseerd op de resultaten van in vitro-experimenten waaruit blijkt dat de incubatie van bloedplaatjesrijk plasma van controlepersonen gedurende een periode van 6 of 12 uur met cafeïne of SCH 58261 geen invloed had op de bindingsparameters.15 De upregulatie van adenosine A2A-receptoren veroorzaakt door chronische inname van cafeïne zou kunnen worden geïnterpreteerd als een aanwijzing dat endogeen adenosine een tonische invloed heeft op menselijke bloedplaatjes, en dat de aanwezigheid van de antagonist wordt gecompenseerd door de upregulatie van A2A-receptoren. Bij volwassenen wordt cafeïne efficiënt geadsorbeerd uit het maagdarmkanaal; de piekplasmaconcentraties treden 15 tot 120 minuten na inname op, en de halfwaardetijd van cafeïne is 2,5 tot 4,5 uur.7 De toename van adenosine A2A receptoren die werd gevonden op 1 uur na de laatste dosis van cafeïne behandeling was vergelijkbaar met die verkregen op 12 of 60 uur na cafeïne ontwenning, waaruit blijkt dat de ontwenning niet noodzakelijk was voor de upregulatie van A2A receptoren.

Een ander doel van de huidige studie was om te bepalen of de veranderingen in bindingsparameters gecorreleerd waren met veranderingen in functionele respons(en). Er werd vastgesteld dat de aggregatie van bloedplaatjes gepaard ging met activering van adenylaatcyclase en met een stijging van de intracellulaire calciumconcentraties. De werkzaamheid van HE-NECA op 12, 60 en 108 uur na de ontwenning van cafeïne was significant verhoogd ten opzichte van de controlegroep. Deze bevinding wijst erop dat herhaalde toediening van verschillende doses cafeïne leidt tot significante veranderingen in het aantal A2A-receptoren op het bloedplaatjesoppervlak, gepaard gaande met een verhoogde responsiviteit op receptorstimulatie. De klassieke adenosine A2A receptor is verantwoordelijk voor de anti-aggregatoire eigenschappen van adenosine en zijn analogen, hetgeen consistent is met de waarneming dat aggregatie efficiënter is in muizen die de A2A receptoren missen.8 Echter, bloedplaatjesaggregatie geïnduceerd door toenemende concentraties ADP was niet significant verschillend tussen controle en cafeïne behandelde proefpersonen. Een mogelijke verklaring voor deze laatste waarneming is dat er niet genoeg adenosine in het testmedium aanwezig is om een respons te veroorzaken. Een andere mogelijkheid is dat bij de met cafeïne behandelde proefpersonen de omvang van de receptor upregulatie (d.w.z. het aantal receptoren) niet voldoende was om een verschuiving van de ADP-geïnduceerde aggregatie concentratie-reactie curve te veroorzaken. Echter, wanneer de niveaus van endogene adenosine stijgen, zoals tijdens myocardiale ischemie, stijgt de extracellulaire concentratie van adenosine snel tot een niveau dat voldoende is om in te werken op geüpreguleerde receptoren en kan een groter bloedplaatjes-remmend effect hebben dan bij controle. Het is dus mogelijk dat chronische cafeïneconsumptie in doses die niet veel afwijken van de gemiddelde inname via de voeding, kan leiden tot een paradoxale vermindering van de aggregabiliteit van bloedplaatjes tijdens ischemie.

Concluderend leveren alle gegevens samen verder bewijs dat chronische inname van cafeïne de reactie van bloedplaatjes op de inwerking van adenosine verandert. De belangrijkste bevinding van de huidige studie is dat de effecten van chronische cafeïneconsumptie op de bloedplaatjesfuncties afhankelijk zijn van zowel de dosis als de duur van de behandeling en ten grondslag liggen aan een vermindering van de aggregabiliteit van de bloedplaatjes als gevolg van een upregulatie van de adenosine A2A-receptoren.