Cells of the adult human heart

Data reporting

Er werden geen statistische methoden gebruikt om de steekproefgrootte vooraf vast te stellen. De experimenten waren niet gerandomiseerd, en onderzoekers waren niet geblindeerd voor toewijzing tijdens experimenten en uitkomstbeoordeling.

Onderzoeksethiek voor donorweefsels

Hartweefsels (donoren D1-D7 en D11) werden verwerkt in het Wellcome Sanger Institute (Hinxton, VK) en verkregen van overleden transplantatieorgaandonoren na goedkeuring van de ethische commissie voor onderzoek (ref 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee) en geïnformeerde toestemming van de donorfamilies. Hartweefsels (donors H2-H7) werden verwerkt aan de Harvard Medical School (Boston, Massachusetts, VS) en verkregen van overleden orgaandonors na goedkeuring door de Human Research Ethics Board Pro00011739 (Universiteit van Alberta, Edmonton, Canada). Geïnformeerde toestemming van donorfamilies werd verkregen via het institutionele Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE). De cardiovasculaire voorgeschiedenis was voor alle donoren onopvallend (aanvullende tabel 1).

Weefselverkrijging en -verwerking

Weefsel werd verkregen van Britse en Noord-Amerikaanse donoren (D1-7 en 11, H2-7) na circulatoire dood (DCD) (D2, D4-D7 en D11) en na hersendood (DBD) (D1, D3, H2-H7). Bij Britse DCD-donors wordt na een stand-off van vijf minuten en bij DBD de borstkas geopend, de aorta gekruist en worden hartmonsters genomen. Bij Noord-Amerikaanse DBD-donors wordt de aorta gekruist, koude cardioplegie (Celsior) onder druk via de aorta toegediend om het kloppen te stoppen, het hart weggesneden, in koude zoutoplossing gespoeld en monsters genomen. Alle donormonsters waren volledige myocardiale biopsies van de linker en rechter boezem, linker en rechter ventrikels, interventriculaire septum en apex, met doelbewuste uitsluiting van grote epicardiale vetafzettingen. Monsters gebruikt voor single nuclei isolatie werden flash-drozen en opgeslagen bij -80 ° C. Isolatie van enkele cellen en CD45+-verrijking werd uitgevoerd op vers verzamelde monsters. Overgebleven weefsel na kernen en cel isolatie procedures werd formaline-vaste of bevroren in OCT voor aanvullende studies.

Alle weefsels werden bewaard en vervoerd op ijs te allen tijde tot invriezen of weefsel dissociatie om eventuele transcriptionele degradatie te minimaliseren. Eerdere studies naar de post-mortem weefsel stabiliteit van het GTEx consortium op bulk weefsels68 en in enkele cellen69 suggereren slechts kleine veranderingen in weefsels binnen de eerste 24 uur post mortem wanneer opgeslagen in koude omstandigheden.

Single nuclei isolatie

Single nuclei werden verkregen uit flash-bevroren weefsels met behulp van mechanische homogenisatie zoals eerder beschreven70. Weefsels werden gehomogeniseerd met behulp van een 7 ml glazen Dounce weefselmolen set (Merck) met 8-10 slagen van een losse stamper (A) en 8-10 slagen van een strakke stamper (B) in homogenisatiebuffer (250 mM sucrose, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM dithiothreitol (DTT), 1× proteaseremmer, 0.4 U pi-1 RNaseIn, 0,2 U pi-1 SUPERaseIn, 0,1% Triton X-100 in nuclease-vrij water). Het homogenaat werd gefiltreerd door een 40-µm celzeef (Corning). Na centrifugatie (500g, 5 min, 4 ° C) het supernatant werd verwijderd en de pellet werd geresuspendeerd in opslagbuffer (1 × PBS, 4% runderserumalbumine (BSA), 0,2 U pi-1 Protector RNaseIn). Nuclei werden gekleurd met NucBlue Live ReadyProbes Reagents (ThermoFisher) en Hoechst-positieve enkele kernen werden gezuiverd door fluorescente geactiveerde celsortering (FACS) met behulp van influx, XDP of FACSAria (BD Biosciences) (Supplementary Fig. 1). Nuclei zuivering en integriteit werd geverifieerd onder een microscoop, en kernen werden verder verwerkt met behulp van de Chromium Controller (10X Genomics) volgens het protocol van de fabrikant.

Single-cel voorbereiding

Heart weefsels (0.2-0,9 g) werden overgebracht van cardioplegische oplossing in gentleMACS C-buisjes (Miltenyi Biotec) met enzymatische digestie basisoplossing (100 μg ml-1 liberase TH Research grade en 50 μg ml-1 DNase I, HBSS 10 mM HEPES en 30 mM taurine)71. Weefsels werden fijngehakt met een schaar (FST) en automatisch verteerd met behulp van gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) met verwarmingselementen. Cardiomyocyte-verwijderd single-celsuspensie werden gewassen met basisoplossing met 20% foetaal runderserum (FBS) (Gibco), gefiltreerd door 70-urn nylon zeef (BD Falcon), verzameld door centrifugatie (330g, 10 min, 4 ° C) en geresuspendeerd in basisoplossing met 0,2% FBS (Gibco). Cellen werden handmatig geteld drie keer door Trypan blauw uitsluiting na elke centrifugatie en geresuspendeerd in een concentratie van ten minste 2 × 106 ml-1. Enkelvoudige cellen werden verwerkt met behulp van Chromium Controller (10X Genomics) volgens het protocol van de fabrikant.

CD45 + cel verrijking

Celsuspensie werd bereid zoals hierboven beschreven en vervolgens gelabeld met behulp van anti-humaan CD45 monoklonaal antilichaam-geconjugeerde microkorrels volgens het protocol van de fabrikant (Miltenyi Biotec). In het kort werden tot 107 cellen gedurende 15 min bij 4 °C geïncubeerd in 80 μl PBS, BSA, EDTA buffer (1× PBS pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA) met 20 μl CD45 microkorrels. Celsuspensie werd gewassen in PBS, BSA, EDTA buffer eenmaal en verzameld door centrifugatie (330g, 10 min, 4 ° C). De geresuspendeerde cellen werden op MACS LS-kolommen (Miltenyi Biotec) aangebracht. CD45-verwijderde celfractie werd weggegooid na drie wasbeurten met PBS, BSA en EDTA-buffer en de CD45+ celfractie werd verzameld in PBS, BSA en EDTA-buffer door de kolommen uit het magnetische veld te verwijderen. CD45 + cellen werden geteld en geresuspendeerd in PBS, BSA en EDTA buffer tot een concentratie van ten minste 2 × 106 per ml voor verdere verwerking met behulp van een Chromium Controller (10X Genomics) volgens het protocol van de fabrikant.

Chromium 10X bibliotheekbereiding

Enkel cellen en kernen werden handmatig geteld door Trypan blauw exclusie of automatisch met behulp van een Countess II (Life Technologies) met ten minste twee afzonderlijke tellingen. De cel- of celkernsuspensie werd op 400-1.000 cellen per microliter gebracht en op de Chromium Controller (10X Genomics) geladen met een beoogde cel- of celkernterugwinning van 4.000-10.000 per reactie. 3′ genexpressiebibliotheken werden bereid volgens de instructies van de fabrikant van de v2 of v3 Chromium Single Cell Reagent Kits (10X Genomics). Kwaliteitscontrole van cDNA en uiteindelijke bibliotheken werd uitgevoerd met Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) of 4200 TapeStation System (Agilent). Bibliotheken werden gesequenced met behulp van HiSeq 4000 (Illumina) bij het Wellcome Sanger Institute, en NextSeq 500 (Illumina) bij Harvard Medical School met een minimale diepte van 20.000-30.000 gelezen paren per cel of kern (Supplementary Table 22).

Spatiale validatie met behulp van smFISH met RNAscope probes

Tijdens de bereiding van formaline-vaste paraffine-embedded (FFPE) monsters werd vers weefsel gefixeerd in neutraal gebufferde 10% formaline gedurende 18-36 uur en vervolgens ingebed in paraffineblokken. Vastgevroren weefselmonsters werden gefixeerd in 4% paraformaldehyde (ThermoFisher). Met behulp van een microtoom werden secties van 5 μm dikte gesneden en op SuperFrost Plus-glaasjes (VWR) geplaatst. FFPE weefsel dia’s werden automatisch gekleurd met behulp van BOND RX (Leica) en de RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) volgens het protocol van de fabrikant. Gefixeerd-bevroren weefselglaasjes werden verwerkt volgens het protocol van RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio). RNAscope ready- of custom-made target probes werden parallel aan multiplex positieve en negatieve controles uitgevoerd (Extended Data Fig. 12b, Supplementary Table 23). Alle kernen werden DAPI-gekleurd. Alle FFPE weefsel dia’s werden afgebeeld met behulp van een Opera Phenix High-Content confocale Screening System (Perkin Elmer) met een 1-urn z-stap grootte en 20 × water-immersie objectief (NA 0,16, 0,299 um per pixel). Kanalen: DAPI (excitatie 375 nm, emissie 435-480 nm), Atto 425 (excitatie 425 nm, emissie 463-501 nm), opaal 520 (excitatie 488 nm, emissie 500-550 nm), opaal 570 (excitatie 561 nm, emissie 570-630 nm), opaal 650 (excitatie 640 nm, emissie 650-760 nm). Vastgevroren weefselglaasjes werden belicht met een LSM710 confocale microscoop (Zeiss) en 40× olie-immersie objectief (1.3 olie, DIC III). Kanalen: DAPI (excitatie 375 nm, emissie 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (excitatie 492 nm, emissie 517 nm), Atto 550 (excitatie 560 nm, emissie 575 nm) en Atto 647 (excitatie 649 nm, emissie 662 nm). Visualisatie en achtergrondverwijdering (rolling ball radius) werden uitgevoerd met Fiji/ImageJ72. Pseudokleuren werden gebruikt voor een betere visualisatie.

Haematoxyline en eosine kleuring

Weefselmonsters werden vers ingevroren in isopentaan (ThermoFisher) bij -80 ° C en ingebed in OCT (VWR). Secties werden gesneden op een dikte van 10 urn met behulp van een microtoom, geplaatst op SuperFrostPlus dia’s (VWR) en verder verwerkt volgens een standaard hematoxyline en eosine kleuring protocol (Extended Data Fig. 12a).

Acquisitie van skeletspierweefsel

Intercostale spier monsters werden verkregen uit tussen de tweede en derde rib aan de linkerkant. Dit is typisch de diepste spierlaag (het verst verwijderd van de huid). Monsters werden direct verzameld in de koude conserveringsoplossing.

Nuclei isolatie voor skeletspier

Spierweefsel werd gewassen in 1× PBS, gereinigd van alle zichtbare vetafzettingen en fijngehakt tot fragmenten van ongeveer 1 mm3 te verkrijgen. Per monster werd ongeveer 0,3 g gehakt weefsel gehomogeniseerd in 3 ml buffer A (250 mM sucrose, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl 2, 0,12 U pi-1 RNaseIn, 0,06 U pi-1 SUPERASIn, 1 × proteaseremmer) met behulp van Dounce weefselmolen set (Merck) met 50 slagen van de losse stamper (A). Het homogenaat werd gefiltreerd door een 100-urn celzeef (Corning) en de zeef werd gewassen met 1 ml en vervolgens 750 ul buffer A. Na de toevoeging van Triton X-100 (eindconcentratie 0,5%), werd het mengsel verder gehomogeniseerd met 50 slagen van de vaste stamper (B). Na filtratie door een zeef van 40 μm werden de kernen gecentrifugeerd (3.000 g, 5 min, 4 °C), geresuspendeerd in 1 ml buffer B (320 mM sucrose, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM magnesiumacetaat, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× proteaseremmer, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) en gezuiverd met een 27% Percoll-gradiëntoplossing. Het Percoll-mengsel werd gecentrifugeerd bij 20.000 g (15 min, 4 ° C) en de pellet werd geresuspendeerd in 200 ul van buffer B, gevolgd door centrifugatie (20.000 g, 3 min, 4 ° C). Na trypanblauwkleuring werden de intacte kernen geteld met behulp van een hemocytometer. Nuclei werden geprofileerd met behulp van een Chromium Controller (10X Genomics) volgens het protocol van de fabrikant.

Single-cel isolatie voor skeletspier

Spierweefsel werd gewassen in 1 × PBS, gereinigd van alle zichtbare vetafzettingen en fijngehakt. Vervolgens werd 2 g van het fijngehakte weefsel overgebracht naar digestiebuffer 1 (750 U ml-1 collagenase type 2 in 1× PBS) en bij 37 °C in een waterbad gedurende 90 minuten geïncubeerd. Het gedeeltelijk verteerde weefsel is verzameld door centrifugeren (650 g, 5 min, 4 °C) en de pellet is geresuspendeerd in digestiebuffer 2 (100 U ml-1 collagenase type 2, 2 U ml-1 dispase in PBS). Na 30 min incubatie bij 37 °C in een waterbad werd de digestie gestopt door toevoeging van 2% FBS. De cellen werden gefilterd door een nylonfilter van 100 μm en 40 μm (BD Falcon), verzameld door centrifugeren (650 g, 4 °C, 3 min) en gewassen met 1× PBS, 2% FBS. Vervolgens werd een 20% Percoll gradiënt (15.000g, 4 ° C, 20 min) gebruikt voor celzuivering. De laag met cellen werd verzameld, gewassen in PBS met 2% FBS, en levensvatbare cellen werden geteld door Trypan Blue exclusie met behulp van een hemocytometer. Nuclei werden geprofileerd met behulp van een Chromium Controller (10X Genomics) volgens het protocol van de fabrikant.

De methoden belangrijkste middelen tabel is in Supplementary Table 24.

Transcriptoom mapping

Na sequencing, werden monsters gedemultiplexed en opgeslagen als CRAM-bestanden. Elk monster werd in kaart gebracht tegen het menselijke referentiegenoom (GRCh38 v.3.0.0) geleverd door 10X Genomics, en met behulp van de CellRanger suite (v.3.0.1) met standaard parameters. Single-cell monsters werden in kaart gebracht tegen de referentie zoals die werd verstrekt. Single-nuclei monsters, de referentie voor pre-mRNA, werd gemaakt met behulp van de 10X Genomics instructies (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references).

Telling gegevensverwerking

Na mapping, monsters van elke gegevensbron (single nuclei, enkele cel en CD45 + cel) werden gegroepeerd in individuele AnnData objecten door concatenating de raw_feature_bc_matrix_h5.h5 en voeg de juiste metadata informatie. Voor elke gegevensbron object, het gemiddelde van de unieke moleculaire identifiers (UMI’s) (n_counts) werd berekend en gebruikt als een drempel voor lege druppels.

Doublet detectie

Na verwijdering van lege druppels, pasten we scrublet73 om een doublet score (scrublet_score) toe te kennen aan elke cel. Deze cellen werden geclusterd en gevisualiseerd met behulp van de UMAP-methode74. Bovendien werd elke cel verwerkt voor doublet detectie met behulp van een percolatie methode om voor een betere detectie van doubletten75.

Cell kwaliteitscontrole en filtering

Elke gegevensbron werd afzonderlijk verwerkt en geannoteerd om rekening te houden voor bron-specifieke kwaliteitsverschillen. Deze metrieken zijn opgenomen als covariaten voor verdere verwerking. Totaal cellen en CD45 + cellen werden gefilterd voor tellingen (500 < n_counts <15,000), genen (200 < n_genes), mitochondriale genen (percent_mito <20%), ribosomale genen (percent_ribo <20%) en scrublet score (scrublet_score <0.3). Single kernen werden gefilterd voor tellingen (500 < n_counts <15.000), genen (300 < n_genes <6.000), mitochondriale genen (percent_mito <5%), ribosomale genen (percent_ribo <5%) en scrublet score (scrublet_score <0,3). Dezelfde filtering drempels werden toegepast op de skeletspier dataset.

Scanpy toolkit 1.576 in Python v.3.7 werd gebruikt om downstream-analyses uit te voeren, met inbegrip van normalisatie (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10.000), log-transformatie (log1p), variabele gen detectie (highly_variable_genes), regressing uit ongewenste bronnen van variatie (regress_out: n_counts en percent_mito), data feature scaling (schaal: max_value = 10) en PCA (pca: met behulp van zeer variabele genen) zoals eerder beschreven77.

Batch uitlijning met behulp van diepe variationele autoencoder

We bouwden een globale manifold door het afstemmen van alle gegevensbronnen en donoren in onze gegevens. Dit werd gedaan in een procedure in drie stappen: (1) Elke bron werd afzonderlijk geanalyseerd en geannoteerd, uitlijnen alleen voor donoren met behulp van een pericyte-ruimte lineaire regressie stap vóór batch uitlijning met bbknn78. Differentieel tot expressie komende genen (DEG’s) werden berekend met behulp van een Wilcoxon rank sum test met Bonferroni-Hochberg aanpassing zoals geïmplementeerd in het Scanpy framework. (2) Om elk cluster te annoteren, gebruikten we een integratieve aanpak door te zoeken in de top significante DEGs (P < 1 × 10-5) met een logFC >1 tegen de ToppFun79 en EnrichR80 databases. Significante hits op pathways, transcriptionele regulatie en biologische processen werden geprioriteerd om een bepaalde cluster te annoteren. Elk celcompartiment werd gelabeld onder het adata.obs slot na groepering van bronspecifieke celtoestanden. (3) Alle bronnen werden gecombineerd in één enkel AnnData-object onder het label adata.obs. Batches werden uitgelijnd met behulp van de batch_correctie functie van de scGen variationele autoencoder81. Eerst lijnden we uit voor adata.obs, met adata.obs als anker. Vervolgens lijnden we uit voor adata.obs, met adata.obs als anker. Elke batch alignment ronde werd uitgevoerd voor 50 epochs.

Manifolds voor de adipocyten, vasculaire en immuun cardiale populaties, evenals de skeletspier analyse, werden gemaakt met behulp van deze methode en de clustering nauwkeurigheid werd geëvalueerd met SCCAF82 (Extended Data Fig. 12d).

DEGs

Om te helpen met de annotatie van de subpopulaties van elk celcompartiment, berekenden we de DEGs met behulp van de Wilcoxon rank sum test zoals geïmplementeerd in de scanpy workflow en aanbevolen door recente benchmarking studies83. Een gen werd beschouwd als differentieel tot expressie als het een log2-getransformeerde vouwverandering > 1 en een P < 1 × 10-5, tenzij anders vermeld in de analyse sectie.

Cel-cel interacties

Expressie matrices van de bestudeerde populaties werden geëxporteerd uit de AnnData, samen met een metadata tabel die de cel-barcodes bevatte als indices. Vervolgens werd CellPhoneDB als volgt uitgevoerd: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. CellPhoneDB ruwe voorspellingen werden gefilterd door het verwijderen van die interacties met een P > 1,0 × 10-5. Significante paren werden vervolgens ingediend voor gen set verrijking analyse in ReactomeDB, enrichR en ToppFun voor functionele classificatie. De vasculaire cellen werden willekeurig sub-bemonsterd tot 39.000 cellen voor de analyse, en de cardiale reparatie groep (atriale en ventriculaire cardiomyocyten, FBs, en immuuncellen) werd willekeurig sub-bemonsterd tot 69.295 cellen voor de analyse.

Visualisatie van genexpressie op 10X Genomics Visium gegevens

We verwerkten de publiek beschikbare linker ventrikel myocardium Visium gegevens van 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) met behulp van de Scanpy v.1.5 workflow aangepast voor de analyse van 10X Genomics Visium gegevens (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). In het kort werden spots verwijderd met minder dan 500 UMI’s of meer dan 20.000 UMI’s, en minder dan 200 genen. Gegevens werden log-getransformeerd en genormaliseerd vóór plotting.

RNA-snelheid schatten

Om de RNA-snelheid van de enkele cellen en CD45 + verrijkte enkele cellen te berekenen, gebruikten we de CellRanger uitgang BAM-bestand en de GENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) bestand samen met de velocyto84 CLI v.0.17.17 tot een weefgetouw-bestand met de kwantificering van gespliced en niet-gespliced RNA te genereren. Vervolgens bouwden we een manifold, clusteren de cellen en visualiseren van de RNA snelheden met behulp van scVelo85.

Subpopulatie analyses van atriale en ventriculaire cardiomyocyten, FB’s en neuronale cellen

Alle streepjescodes gelabeld in het globale object als cardiomyocyten, fibroblasten en neurale cellen werden geselecteerd voor verdere subpopulatie analyses. Aanvullende celpopulatie-specifieke filtering criteria werden toegepast op kernen als volgt: cardiomyocyten telt (n_counts <12,500), genen (n_genes <4,000), mitochondriale genen (percent_mito <1%), ribosomale genen (percent_ribo <1%) en scrublet score (scrublet_score <0.25); FB mitochondriale genen (percent_mito <1%), ribosomale genen (percent_ribo <1%); neuronale celgenen (n_genes <4000), mitochondriale genen (percent_mito <1%), ribosomale genen (percent_ribo <1%). Totaal en CD45 + cellen werden uitgesloten in de atriale en ventriculaire cardiomyocyten datasets en droegen niet bij aan subpopulatie analyse. Geen verdere filtering van FBs of neuronale cel totaal en CD45 + cellen werd toegepast. Cardiomyocyten en FBs werden vervolgens verder opgesplitst in twee groeperingen op basis van de regio van herkomst: (1) linker en rechter atrium, en (2) linker en rechter ventrikels, apex en interventriculaire septum.

Donor effecten werden uitgelijnd zoals beschreven in stap (1) hierboven. Voor FB en neuronale cellen, werden bronnen uitgelijnd als beschreven in stap (3) hierboven. Leiden clustering en UMAP visualisatie werden uitgevoerd voor het identificeren van subpopulaties en visualisatie86. Differentieel tot expressie komende genen werden berekend met behulp van de Wilcoxon rank sum test. Genen werden gerangschikt op score.

Cross-tissue vergelijking van cardiale immuunpopulaties met skeletspier, nieren en bloed immuunpopulaties

We verzamelden single-cell transcriptoom gegevens voor volwassen nieren van ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/), en subset alle immuuncellen gerapporteerd in hun studie. Voor de SKM selecteerden we de geannoteerde immuuncellen uit de samengevoegde manifold. Voor het menselijk bloed, gebruikten we de publiek beschikbare 10.000 enkele PBMC-cellen dataset verstrekt door 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3). Zoals eerder beschreven87, trainden we een logistisch regressiemodel op de cardiale immuuncellen met behulp van 80% van de expressiegegevens en testten de nauwkeurigheid ervan op de resterende 20% om een model te produceren met een nauwkeurigheid van 0,6862 (Extended Data Fig. 8f, Supplementary Table 16). We pasten dit model vervolgens toe om analoge cardiale immuun populaties te voorspellen in de volwassen nier, SKM en PBMCs. Voorspellingen met een waarschijnlijkheid van minder dan 0,8 werden uitgesloten van downstream vergelijkende analyses.

Gene Ontologie verrijkingsanalyse

Voor de ventriculaire cardiomyocyten populatie, gebruikten we het R-pakket gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) met de score-gerangschikte genenlijst van vCM4 als input en de set van genen die tot expressie komen in ventriculaire cardiomyocyten als achtergrond (de genen met een UMI telling >1). Voor het uitvoeren van de Gene Ontology analyse op de vasculaire cellen, de top 500 significante DEG’s (P < 1 × 10-5) met een log-getransformeerde vouwverandering > 1 werden gezocht tegen de Gene Ontology biologisch proces database met behulp van ToppFun79 (Supplementary Table 25). De top vijf significant verrijkt termen (q < 0,05) voor elke subpopulatie werden geselecteerd en uitgezet op een warmte-kaart. Voor het uitvoeren van de pathway analyse op de adipocyten, de top 500 significante DEG’s (P < 1 × 10-5) met een log-getransformeerde vouwverandering > 0,5 werden gezocht tegen ToppFun79 pathway databases (Supplementary Table 26). De top vijf significant verrijkt paden (q < 0,05) voor elke subpopulatie werden geselecteerd en uitgezet op een heat map.

Gen set score

We gebruiken de score_genes functie zoals geïmplementeerd in scanpy aan de verrijking van genen die betrokken zijn bij de Oncostatine M-pathway te berekenen. Een lijst van genen werd verzameld op basis van literatuuronderzoek88,89. Voor de verrijking van genenverzamelingen werden alleen hoog tot expressie komende genen in aanmerking genomen om ruis te verminderen (meer dan 500 UMI’s in alle cellen). Dezelfde analyse werd uitgevoerd voor de vergelijking van cardiale immuuncellen in onze studie met de waarnemingen van eerdere studies over cardiale-resident macrofagen51, muis weefsel-remodelling macrofaag45 en dooierzak lineage oorsprong90.

Statistieken en reproduceerbaarheid

Alle analyses werden uitgevoerd met behulp van R Software, v.3.6.1. Student’s t-tests werden gebruikt om celtype distributies te vergelijken op elke site. P < 0,05 werd als statistisch significant beschouwd. Lineaire regressiemodellen (correlaties) werden verkregen met behulp van de R lineaire modelfunctie (lm), waarmee de statistische waarschijnlijkheid (P-waarde) van een lineair verband wordt geschat. Bonferroni correctie werd toegepast voor multiple testing.

De afgebeelde RNAscope microfoto’s in de figuren zijn representatief. De microfoto’s in Fig. 2g, 3c, h en Extended Data Fig. 3c (HAMP), Extended Data Fig. 3e (CNN1), Extended Data Figs. 4g, m, 6f werden herhaald met vergelijkbare resultaten in twee afzonderlijke weefselsecties. De microfoto’s in Fig. 2h, 3f en Extended Data Fig. 3c (CNN1), Extended Data Fig. 3e (PCDH7), Extended Data Fig. 6e, h, 9d werden herhaald met gelijkaardige resultaten in drie afzonderlijke weefselsecties. De microfoto’s in Fig. 1e, 2d, 3e en Extended Data Fig. 1f, 3c (FHL1) en Extended Data Fig. 6d werden herhaald met gelijkaardige resultaten in vier individuele weefselsecties. De microfoto’s in Fig. 2c en Extended Data Fig. 3c (PRELID2), Extended Data Figs. 10e, 12a werden herhaald met gelijkaardige resultaten in zes of meer individuele weefseldoorsneden. Positieve en negatieve controles werden eenmaal gedaan per gebruikte monsters.

GWAS verrijkingsanalyse

We downloadden GWAS samenvattende statistieken van brede cvdi, EBI GWAS catalogus en GWAS atlas. We selecteerden kenmerken met goed gepowerde GWAS (n > 5.000 en aantal significante loci >10). GWAS datasets zijn samengevat in supplementaire tabel 27. Genexpressiegegevens van eiwit-coderende genen werden in kaart gebracht op Entrez gen-id’s en deze gen-annotaties werden gebruikt op de humane genoom-assemblage hg19/37. We gebruikten alleen genexpressiegegevens van kernen. We implementeerden de eerder beschreven analyse64 in python en in R. De log-getransformeerde tellingen (plus een pseudotelling) werden gebruikt om gemiddelde celtype-specifieke expressieprofielen te berekenen. We voerden individuele magma-analyses uit voor elk celtype, steeds conditionerend op standaard genniveau covariaten (bijvoorbeeld genlengte) en gemiddelde genexpressie over alle cellen. Vervolgens pasten wij de Benjamini-Hochberg methode toe en selecteerden celtype kenmerk associaties met FDR < 10%. Deze paren werden vervolgens onderworpen aan conditionele analyse zoals eerder beschreven64 om ‘onafhankelijke’, ‘gezamenlijk verklaarde’ en ‘gedeeltelijk gezamenlijk verklaarde’ paren van associaties te definiëren (Supplementary Table 28).

Distributies van gedispergeerde cellen en geïsoleerde kernen

De verschillende procedures voor het verkrijgen van geïsoleerde kernen en gedispergeerde cellen resulteerden in significant verschillende distributies van celtypes (Supplementary Table 29, Extended Data Fig. 2). Met name 30,1% en 49,2% van de geïsoleerde kernen waren afkomstig van atriale en ventriculaire cardiomyocyten in de atriale en ventriculaire regio’s, terwijl deze cellen meestal werden uitgesloten van bereidingen van geïsoleerde en CD45-geselecteerde cellen (Supplementary Table 2).

Exclusief cardiomyocyten, bleef de verdeling van celtypen geïdentificeerd uit geïsoleerde kernen en gedispergeerde cellen verschillend (Supplementary Table 30). Hoewel 59,0% van de gedispergeerde cellen EC’s waren, was slechts 15,7% van de kernen afkomstig van EC’s. Daarentegen waren 64,2% van de kernen afkomstig van FBs (31,2%) en pericyten (33,0%), terwijl slechts 17,1% van de gedispergeerde cellen bestond uit FBs (2,3%) en pericyten (14,8%). Deze verschillen kunnen de gevoeligheid van EC kernen voor isolatie procedures of weerstand van pericyten en FBs tegen cellulaire enzymatische digestie weerspiegelen.

Ondanks verschillen in cel distributies tussen geïsoleerde kernen en verspreide cellen, de genexpressie profielen van cellijnen waren redelijk gecorreleerd (r > 0,4 voor elk celtype). Om de concordantie van de genen vastgelegd door cellen en kernen aan te pakken, vergeleken we de expressie van de belangrijkste celtype markers uit Fig. 1c over de drie bronnen (Extended Data Fig. 1c). Aangezien kernen geen cytoplasmatisch RNA bevatten, was de expressie van bepaalde genen, met name de immuungenen NKG7 en C1QA, lager in kernen dan in cellen. Niettemin was de algemene trend met betrekking tot markergenen consistent over de drie bronnen, en dezelfde genen onderscheidden individuele celtypes onafhankelijk van de bron.

Volgende analyse van vasculaire cellen

De PC3_str bevatte een vergelijkbare bijdrage van cellen en kernen, en had een scrublet-score onder de gebruikte stringente drempel; niettemin was het gemiddelde aantal genen en tellingen in deze cluster hoger dan gemiddeld. Ondanks onze strenge kwaliteitsfiltering kunnen we dus niet uitsluiten dat er in dit cluster doubletten voorkomen. EC10_CMC-like en PC4_CMC-like co-expresseren EC of pericyte genen met cardiomyocyte markers en verdere studies zijn nodig om te begrijpen of zij voorheen onbekende celtoestanden of doubletten vertegenwoordigen.

De waarnemingen van de arteriële en veneuze SMC worden ondersteund door eerdere studies, die voorspellen dat arteriële SMCs meer contractiel zijn, en veneuze SMCs minder gedifferentieerd zijn91.

EC3_cap verrijken voor transcripten die coderen voor componenten van AP1 (JUN en FOS), dat meerdere EC lotbeslissingen medieert, waaronder de reactie op VEGF, ontstekings- en stresssignalen, en ATF3, een adaptief-respons-gen geïnduceerd door diverse signalen92,93,94.

Skeletspierkarakterisering

We verzamelden intercostale skeletspiermonsters van vijf gezonde personen, waaronder één donor met gematcht hartweefsel, en profileerden het transcriptoom van 35.665 afzonderlijke cellen en 39.597 afzonderlijke kernen. Analoog aan het hart, stelde de combinatie van cellen en kernen ons in staat om de belangrijkste cellijnen vast te leggen en op te lossen, waaronder cardiomyocyten, fibroblasten, endotheelcellen, gladde spiercellen, pericyten, myeloïde en lymfoïde immuuncellen en satellietcellen (Extended Data Fig. 11a, b, Supplementary Table 31).

Verder analyse van de vasculaire cellen van de skeletspier identificeerde tien verschillende populaties. De endotheelcellen vertoonden vijf clusters gescheiden op basis van hun respectieve vasculaire bedden met handtekeningen vergelijkbaar met die we waarnemen in het hart. De EC_cap brengt VWF en RGCC tot expressie. Veneuze EC_ven drukken ACKR1 en PLVAP uit, terwijl arteriële EC_art SEMA3G en HEY1 vertonen, in lijn met onze hartgegevens (Extended Data Fig. 11c, d, Supplementary Table 32).

De algemene distributies van vasculaire en stromale celpopulaties in skeletspier en hartspier waren vergelijkbaar, met inbegrip van de arteriële en veneuze kenmerken van ECs; echter; skeletspier bevatte een enkele SMC-cluster, mogelijk gerelateerd aan de kleinere omvang van de dataset. In skeletspier omvatten de voorspelde cel-cel interacties van de EC_art en SMC’s NOTCH1/4-JAG1 evenals JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, maar niet JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2, afgeleid in het hart (Extended Data Fig. 11e, f, Supplementary Table 33).

Cardiale immuuncellen

Met behulp van het logistische regressiemodel identificeerden we geen tegenhanger van de cardiale IL17RA+ monocyten in SKM of nieren, mogelijk als gevolg van de kleine omvang van deze populatie.

Naïeve T-cellen (CD4+T_naïef) die werden geïdentificeerd, brachten CCR7 en SELL tot expressie, wat duidt op hun naïeve en weefsel-residente aard95. Geheugen T-cellen (CD8 + T_tem) uitgedrukt BACH2, STAT4 en IL7R, geassocieerd met lange termijn immuun geheugen96,97. We karakteriseerden de lymfoïde cellen verder met behulp van scNym98, en trainden het met behulp van gepubliceerde gegevens99,100. Het resulterende model werd toegepast op onze cardiale immuuncellen en de cellen met een voorspelde score hoger dan 0,8 werden verondersteld waarschijnlijk kandidaten voor herannotatie te zijn. Met deze aanpak identificeerden wij kandidaten voor plasma B-cellen (109), dendritische cellen (645), aangeboren lymfoïde cellen (89), MAIT T-cellen (219), T-helpercellen (80), T-regulatorcellen (11), T- centrale geheugencellen (103), γδ T-cellen (30) en plasmocytoïde dendritische cellen (27). Deze annotaties zijn te vinden in de cardiale immuun object annotaties onder het label ‘scNym’ op www.heartcellatlas.org.

Rapportage samenvatting

Verder informatie over de onderzoeksopzet is beschikbaar in de Nature Research Reporting Summary gelinkt aan dit artikel.