Het basisplan van eiwitsynthese in eukaryoten en archaea is vergelijkbaar met dat in bacteriën. De belangrijkste structurele en mechanistische thema’s komen in alle domeinen van het leven terug. De eukaryote eiwitsynthese omvat echter meer eiwitcomponenten dan de prokaryote eiwitsynthese, en sommige stappen zijn ingewikkelder. Hieronder volgen enkele opmerkelijke overeenkomsten en verschillen:
Ribosomen. Eukaryote ribosomen zijn groter. Zij bestaan uit een 60S grote subeenheid en een 40S kleine subeenheid, die samen een 80S deeltje vormen met een massa van 4200 kd, vergeleken met 2700 kd voor het prokaryotische 70S ribosoom. De 40S-subeenheid bevat een 18S RNA dat homoloog is aan het prokaryotische 16S RNA. De 60S-subeenheid bevat drie RNA’s: de 5S- en 28S-RNA’s zijn de tegenhangers van de prokaryotische 5S- en 23S-moleculen; het 5,8S-RNA is uniek voor eukaryoten.
Initiator tRNA. Bij eukaryoten is het initiërende aminozuur methionine in plaats van N-formylmethionine. Net als bij prokaryoten neemt echter een speciaal tRNA deel aan de initiatie. Dit aminoacyl-tRNA wordt Met-tRNAi of Met-tRNAf genoemd (het subscript “i” staat voor initiëring, en “f” geeft aan dat het in vitro kan worden geformyleerd).
Initiëring. Het initiërende codon bij eukaryoten is altijd AUG. Eukaryoten gebruiken, in tegenstelling tot prokaryoten, geen specifieke purinerijke sequentie aan de 5′-zijde om initiërende AUG’s van interne te onderscheiden. In plaats daarvan wordt meestal de AUG die zich het dichtst bij het 5′-uiteinde van het mRNA bevindt, als startpunt gekozen. Een 40S ribosoom hecht zich aan de kap aan het 5′-uiteinde van eukaryotisch mRNA (Paragraaf 28.3.1) en zoekt naar een AUG codon door stap voor stap in de 3′-richting te bewegen (Figuur 29.33). Dit aftastproces in de eukaryote eiwitsynthese wordt aangedreven door helicasen die ATP hydrolyseren. Het paren van het anticodon van Met-tRNAi met het AUG codon van mRNA geeft aan dat het doel gevonden is. In bijna alle gevallen heeft eukaryotisch mRNA slechts één startplaats en is het dus het sjabloon voor één enkel eiwit. Daarentegen kan een prokaryotisch mRNA meerdere Shine-Dalgarno sequenties en dus startplaatsen hebben, en kan het dienen als sjabloon voor de synthese van meerdere eiwitten. Eukaryoten maken gebruik van veel meer initiatie-factoren dan prokaryoten, en hun samenspel is veel ingewikkelder. Het voorvoegsel eIF staat voor een eukaryotische initiatiefactor. Zo is eIF-4E een eiwit dat direct bindt aan de 7-methylguanosine cap (Paragraaf 28.3.1), terwijl eIF-4A een helicase is. Het verschil in initiatiemechanisme tussen prokaryoten en eukaryoten is ten dele een gevolg van het verschil in RNA-verwerking. Bij prokaryoten is het 5′-uiteinde van het mRNA onmiddellijk na de transcriptie beschikbaar voor de ribosomen. In eukaryoten daarentegen moet het pre-mRNA worden verwerkt en naar het cytoplasma getransporteerd voordat met de translatie wordt begonnen. Er is dus ruim gelegenheid voor de vorming van complexe secundaire structuren die moeten worden verwijderd om signalen in het rijpe mRNA bloot te leggen. Het 5′ kapje biedt een gemakkelijk herkenbaar beginpunt. Bovendien biedt de complexiteit van eukaryote translatie-initiatie nog een ander mechanisme voor genexpressie, dat we in hoofdstuk 31 verder zullen onderzoeken.
Verlenging en beëindiging. Eukaryote elongatiefactoren EF1α en EF1βγ zijn de tegenhangers van prokaryotische EF-Tu en EF-Ts. De GTP-vorm van EF1α levert aminoacyl-tRNA aan de A-locatie van het ribosoom, en EF1βγ katalyseert de uitwisseling van GTP voor gebonden GDP. Eukaryotisch EF2 medieert GTP-gedreven translocatie op vrijwel dezelfde wijze als prokaryotisch EF-G. De terminatie in eukaryoten wordt uitgevoerd door één enkele release factor, eRF1, vergeleken met twee in prokaryoten. Tenslotte voorkomt eIF3, net als zijn prokaryote tegenhanger IF3, de reassociatie van ribosomale subeenheden bij afwezigheid van een initiatiecomplex.
Figuur 29.33
Eukaryote translatie-initiatie. In eukaryoten begint de translatie-initiatie met de assemblage van een complex op de 5′ cap dat de 40S-subeenheid en Met-tRNAi omvat. Gedreven door ATP hydrolyse, scant dit complex het mRNA tot de eerste AUG (meer…)
29.5.1. Veel antibiotica werken door de eiwitsynthese te remmen
De verschillen tussen eukaryotische en prokaryotische ribosomen kunnen worden benut voor de ontwikkeling van antibiotica (tabel 29.4). Zo remt het antibioticum puromycine de eiwitsynthese door ervoor te zorgen dat ontluikende prokaryote polypeptideketens worden losgelaten voordat hun synthese is voltooid. Puromycine is een analoog van het terminale aminoacyl-adenosine-deel van aminoacyl-tRNA (figuur 29.34).
Tabel 29.4
Antibiotische remmers van de eiwitsynthese.
Figuur 29.34
Antibiotische werking van Puromycine. Puromycine lijkt op de aminoacyl terminus van een aminoacyl-tRNA. Zijn aminogroep verbindt zich met de carbonylgroep van de groeiende polypeptideketen om een adduct te vormen dat van het ribosoom dissocieert. Dit adduct is stabiel omdat (meer…)
Het bindt zich aan de A-locatie op het ribosoom en remt de opname van aminoacyl-tRNA. Bovendien bevat puromycine een α-aminogroep. Deze aminogroep vormt, net als die op aminoacyl-tRNA, een peptidebinding met de carboxylgroep van de groeiende peptideketen. Het product, een peptide met een covalent bevestigd puromycine-residu aan het carboxyl-uiteinde, dissocieert van het ribosoom.
Streptomycine, een zeer basisch trisaccharide, interfereert met de binding van formylmethionyl-tRNA aan ribosomen en verhindert daardoor het juiste begin van de eiwitsynthese. Andere aminoglycoside-antibiotica zoals neomycine, kanamycine en gentamycine interfereren met de decodeerplaats die zich nabij nucleotide 1492 in 16S rRNA van de 30S subeenheid bevindt (Paragraaf 29.3.9). Chlooramfenicol werkt door het remmen van peptidyltransferase-activiteit. Erytromycine bindt zich aan de 50S-subeenheid en blokkeert translocatie. Ten slotte blokkeert cyclohexamide de peptidyltransferase-activiteit in eukaryote ribosomen, waardoor het een nuttig laboratoriumhulpmiddel is voor het blokkeren van de eiwitsynthese in eukaryote cellen.
29.5.2. Diphtheria Toxin Blocks Protein Synthesis in Eukaryotes by Inhibiting Translocation
Diphtheria was a major cause of death in childhood before the advent of effective immunization. De dodelijke effecten van deze ziekte zijn voornamelijk te wijten aan een eiwittoxine dat wordt geproduceerd door Corynebacterium diphtheriae, een bacterie die groeit in de bovenste luchtwegen van een besmet persoon. Het gen dat het toxine codeert, is afkomstig van een lysogene faag die door sommige stammen van C. diphtheriae wordt gedragen. Een paar microgram difterietoxine is gewoonlijk dodelijk voor een niet-geïmmuniseerd persoon omdat het de eiwitsynthese remt. Het toxine wordt kort na binnenkomst in een doelwitcel gesplitst in een 21-kd A-fragment en een 40-kd B-fragment. Het A-fragment van het toxine katalyseert de covalente modificatie van een belangrijke component van de eiwitsynthesemachine, terwijl het B-fragment het mogelijk maakt dat het A-fragment in het cytosol van zijn doelcel terechtkomt.
Een enkel A-fragment van het toxine in het cytosol kan een cel doden. Waarom is het zo dodelijk? Het doelwit van het A-fragment is EF2, de elongatiefactor die translocatie katalyseert bij de eukaryotische eiwitsynthese. EF2 bevat diphthamide, een ongebruikelijk aminozuurresidu met onbekende functie dat wordt gevormd door posttranslationele modificatie van histidine. Het A-fragment katalyseert de overdracht van de adenosinedifosfaat ribose-eenheid van NAD+ aan een stikstofatoom van de difthamidering (Figuur 29.35). Deze ADP-ribosylering van een enkele zijketen van EF2 blokkeert zijn vermogen om translocatie van de groeiende polypeptideketen uit te voeren. De eiwitsynthese stopt, hetgeen de opmerkelijke toxiciteit van difterietoxine verklaart.
Figuur 29.35
Blokkering van translocatie door difterietoxine. Difterietoxine blokkeert de eiwitsynthese in eukaryoten door de overdracht te katalyseren van een ADP-ribose-eenheid van NAD+ naar difthamide, een gemodificeerd aminozuurresidu in elongatiefactor 2 (translocase). Difthamide (meer…)