Dose and Time Effects of Caffeine Intake on Human Platelet Adenosine A2A Receptors

コーヒー、お茶、チョコレート、コーラドリンクなど様々なものに含まれるカフェインは、世界で最も広く存在する活性物質である。 カフェインは、警戒心の増加、精神運動反応時間の短縮、睡眠潜時および覚醒時間の増加など、多様な薬理反応を引き起こし、知的能力にも影響を与える可能性があります2。 さらに、カフェインは平滑筋を弛緩させ、胃酸の分泌やカテコールアミンの放出を促進し、代謝活性を高めます3

カフェインの作用の根底にある正確なメカニズムは、まだ十分に定義されていません。 カフェインは、A2A受容体に最も強く作用し、次いでA1受容体、A2B受容体、6と続き、ヒトA3受容体には弱いアンタゴニストとして作用することが分かっています。 カフェインによるアデノシン受容体、すなわちA1およびA2A受容体タイプの遮断は、内因性アデノシンの様々な生理的過程への作用を阻害する。7 通常の条件下では、血中アデノシンレベルは血小板のA2A受容体を調性活性化するのに十分であると思われる。 最近、A2A受容体ノックアウトマウスにおいて、血小板凝集が増加したことが報告され、この受容体サブタイプが血小板機能において重要であることが示された8。

長年、コーヒーの飲用と心血管疾患、特に冠動脈疾患との関連が疑われてきましたが、最近、コーヒーやカフェインの摂取は冠動脈疾患や脳卒中のリスクを高めないことが証明されています1011。 心筋梗塞を考慮した数多くの疫学的研究では、1日あたり<5杯のコーヒーには悪影響がないことが分かっているが、それ以上の摂取レベルでは結果が分かれる。12 高血圧患者では、どのレベルのカフェイン摂取でも有害な転帰リスクが観察されなかった13。

Biaggioniらによる研究14は、カフェインの反復投与レジメンが、アデノシン受容体作動薬5′-N-エチルカルボキサミドアデノシン（NECA）に対する機能反応において、ヒト血小板に著しい変化をもたらすことを発見しました。 カフェイン離脱は、NECAによる凝集抑制の著しい左方へのシフトをもたらした14。 これと同様に、我々は最近、750 mg/日を1週間投与した被験者15において、カフェインの慢性摂取が、血小板表面に存在するA2A受容体のアップレギュレーションの結果として、血小板凝集性を変化させることを実証した。 本研究では、アデノシンA2A受容体の変化（密度および親和性）とその機能を直接測定することにより、A2A選択的アゴニスト2-hexynyl-NECA（HE-NECA）の、（1）cAMP蓄積増加、（2）血小板凝集抑制、（3）細胞内カルシウムレベル減少の影響を明らかにすることでこれを実現した。 慢性摂取（600 mg/d、1週間または400 mg/d、2週間）後、血小板アデノシンA2A受容体の発現上昇が認められ、抗凝集作用、cAMP蓄積の上昇および細胞内カルシウムレベルの低下と高い相関が認められた。 400 mg/日を1週間投与した被験者からは、結合パラメータおよび機能パラメータに差異は認められなかった。

方法

25歳から45歳の健康な非喫煙者、男女45名を対象に調査を行った。 文書による同意の後、被験者には2週間以上メチルキサンチン類の摂取を控えるよう求めた。 カフェイン投与方法（投与量、投与期間）により、200mgを1日2回7日間経口投与（第1群）、200mgを1日2回14日間経口投与（第2群）、200mgを1日3回7日間経口投与（第3群）に分けた（各群15名）。 これらの被験者の血小板を、カフェイン投与前（0日目）、カフェイン最終投与後1時間、12時間、60時間、108時間に調査した。 特に、1時間後の時点は、カフェインの最大投与量（600 mg/日）を受けたグループでのみ調査された。 4082>

SCH 58261 Binding Assay in Human Platelet Membranes

Membrane from human platelets are previously described16 and used for radioligand binding assay according to Varani et al.17. 飽和試験では、ヒト血小板膜は0.01から10 nmol/Lの範囲で8から10種類の濃度のSCH 58261とインキュベートされた。 非特異的結合はNECA 10μmol/Lの存在下で測定された。 4℃での60分間のインキュベーション後、サンプルをWhatman GF/Bフィルターを通してMicro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co)で濾過した。 飽和実験からのデータのコンピュータ解析には、加重非線形最小二乗曲線フィッティングプログラム、LIGAND18を用いた。

ヒト血小板におけるcAMPレベルの測定

健康なボランティアの末梢血から得た洗浄ヒト血小板を、以前に記載したように準備した16。 血小板（6×104〜8×104個）を1.0 Uのアデノシンデアミナーゼ/mL、0.5 mmol/L 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidazolidinone (Ro 20-1724) as phosphodiesterase inhibitor、6〜8濃度のHE-NECAと共にインキュベートした。 EC50値は、従属変数のlog-logit変換後の濃度-反応曲線から、加重最小二乗法により求めた19。最終水溶液は、競合タンパク質結合試験によりcAMPレベルを試験した15

Platelet Aggregation Assay

クエン酸で処理したヒト血を200g、10分間で遠心し血小板に富む血漿、2500gで20分かけて血小板に乏しい血漿を得た。 ヒト血小板数はコールターカウンターモデルS8/80（コールターエレクトロニクス社製）で行い、自己血小板貧困血漿で2.5×108/mL〜3.5×108/mLに調整した。 血小板凝集は，DIC PA-3220 Aggrecorder（京都第一化学工業株式会社）を用いて，Born turbidimetric technique20に準じて実施した． 6〜8種類の濃度のHE-NECAと3分間インキュベートした後、37℃でADPと連続攪拌しながら、血小板豊富血漿を凝集させた。 同様の実験を異なる濃度のADP（100 nmol/L〜100 μmol/L）を用いて行った。 ADP添加5分後に記録した最大凝集を定量分析に用い、コントロール値に対する阻害率を算出した21

細胞質フリーCa2+濃度測定

細胞質フリーカルシウム濃度は、Paulらによるfura 2法を用いて測定した22． 簡単に説明すると、血小板を1 μmol/L fura 2-AMとともに37℃で30分間完全暗室でインキュベートし、250 μmol/L sulfinpyrazone の存在下で108/mLの濃度で蛍光計キュベット (LS50, Perkin Elmer, Ltd) に入れて磁気撹拌を行った。 細胞内Ca2+濃度（i）は励起比340/380、発光波長505nmで測定した。

統計解析

データの解析は1-way ANOVAで実施した。 カフェイン投与群（12、60、108時間）と対照群との差の解析は、Studentのt検定（不対分析）で行った。 差はP<0.01の値で有意とみなした。 すべてのデータは平均±SEMで報告されている。

結果

被験者の3グループの血小板を、カフェイン投与開始前（0日目、コントロール）および最後の投与から1、12、60、108時間後（カフェイン離脱時）に採取した。 4082>

Group 1 (400 mg/d for 1 Week)

結合パラメータにより、コントロールのBmax値は105±6 fmol/mg protein、KD値は 1.28±0.08 nmol/Lであることが判明した。 HE-NECAはコントロールの血小板においてEC50 60±5 nmol/LでcAMPレベルを増加させ、(1) 86±10 nmol/LのIC50で凝集を、(2) 104±8 nmol/LのIC50でカルシウムレベルを抑制することが示された。 グループ2（400 mg/日、2週間）

結合パラメータでは、コントロールのBmax値は110±3 fmol/mg protein、KD値は1.21±0.09 nmol/Lであった。 カフェイン離脱後12時間および60時間では、両時点で受容体密度Bmaxは約20％増加したが、KD値は変化しなかった。 機能実験の結果、アデノシンA2A受容体作動薬であるHE-NECAは、血小板cAMPを増加させる作用が有意に強いことがわかった（すなわち、EC50値はカフェイン離脱後12時間および60時間でそれぞれコントロール値より45％および65％小さかった）。 また、凝集実験および細胞質内遊離カルシウム濃度測定で得られたIC50値にも同様の傾向が認められた（表）。

グループ3（600 mg/日、1週間）

全体として、グループ2と同様のデータが得られた。 SCH 58261はコントロールからの血小板膜において単一の親和性クラスの部位と結合し、Bmaxが100±4 fmol/mg protein、KDが1.27±0.09 nmol/Lであった。 図1Aに示すように、カフェイン離脱1、12、60、108時間後に採取した血小板の膜では、放射性リガンドは同じ親和性で結合したが、結合部位数（Bmax）は有意（P <0.01 ）に増加した。 並行して、A2A受容体作動薬であるHE-NECAに対する血小板の機能的反応も測定した。 表にまとめたように、カフェイン離脱後12時間、60時間、108時間で得られた血小板では、HE-NECAの（1）cAMP生成増加、（2）ADP誘発血小板凝集抑制、（3）カルシウム濃度低下に対する効力は有意に増加した（図1B、1C、および1D）。 また、A2A受容体の密度の増加が、ADPの凝集誘導の効力および／または効率の低下を伴うかどうかを調べるための実験も実施された。 カフェイン離脱後12時間、60時間、108時間におけるADPの血小板凝集能のEC50値はそれぞれ0.7±0.2、0.9±0.1、0.8±0.1μmol/Lで、0.9±0と有意差はない値であることがわかった。2 μmol/Lであり、コントロールの血小板で得られた値である（図2）。

考察

ヒトおよび動物におけるカフェインの長期投与の影響およびカフェインの作用に対する耐性におけるその役割は、議論のあるところである。 マウスの脳におけるA1受容体の増加を示したいくつかの研究では、カフェインによるA1受容体の用量依存的なアップレギュレーションの証拠が見つかった23。さらに、カフェインの慢性消費は、血小板表面にあるA2A受容体のアップレギュレーションの結果として、凝集や血栓形成などの病態生理学的プロセスに潜在的に関与する血小板凝集性の低下をもたらす14かもしれない。 このような変化は、血小板機能の変化に寄与すると考えられるが、カフェインに対する耐性は、アデノシン作用の競合的拮抗薬としてのこのキサンチンの効力を変更しない。26 耐性の現象には、高親和性状態への受容体の移動、Gタンパク質レベルまたはこれらのタンパク質とアデノシン受容体のカップリングの変化、または長期の受容体占有などの他の変化が関与していると考えられる。 特に、カフェインは血漿アデノシン濃度を増加させ、アンタゴニスト離脱後のその減少は、血漿アデノシン濃度の受容体を介した調節を示唆している27。 成人の脳では、アデノシン受容体のアップレギュレーションをもたらすカフェインの慢性投与は虚血障害を軽減するが、急性暴露（受容体拮抗作用）は虚血障害を増加させる28

カフェインの慢性摂取は、アデノシンの作用に対する血小板の反応を変えることが実証されている14。 カフェインの反復投与（750mg/d、1週間）により、A2A受容体の密度が増加し、cAMPの蓄積の増加や血小板凝集の減少など、血小板反応の感作が見られた15。本研究の目的は、カフェインの用量と投与期間が結合パラメータと機能パラメータに及ぼす影響を明らかにすることであった。 そこで、異なる用量（400または600mg/d）を異なるカフェイン摂取期間（1または2週間）投与した被験者のヒト血小板膜におけるアデノシンA2A受容体の密度と親和性の変化を検討した。 具体的には、対照（カフェイン投与前）とカフェイン投与（カフェイン最終投与から1、12、60、108時間後）の被験者について検討した。

カフェイン400mg/日を1週間投与してもA2A受容体の結合と機能パラメータには変化がなかった。 しかし，400 mg/dを2週間または600 mg/dを1週間投与した結果，（1）アデノシンA2A結合部位の著しい増加（アップレギュレーション），（2）cAMP蓄積の上昇，（3）抗凝集作用の増加，（4）A2A受容体作動薬HE-NECAで誘発されるカルシウムレベルの減少が生じた。

A2A受容体のアップレギュレーションはおそらく前駆細胞分化時の新しい受容体の合成に起因し得ると考えられる． この解釈は、カフェインまたはSCH 58261と対照被験者からの血小板豊富血漿を6時間または12時間インキュベートしても、結合パラメータに影響しなかったことを示すin vitro実験の結果に基づいている。15 カフェインの慢性摂取によるアデノシンA2A受容体のアップレギュレーションは、内因性アデノシンがヒト血小板に対して強壮作用を持ち、拮抗薬の存在がA2A受容体のアップレギュレーションによって相殺されることを示していると解釈されるかもしれない。 成人では、カフェインは消化管から効率的に吸着され、血漿濃度のピークは摂取後15〜120分後に起こり、カフェインの半減期は2.5〜4.5時間である7。 カフェイン最終投与から1時間後に見られたアデノシンA2A受容体の増加は、カフェイン離脱後12時間または60時間で得られたものと同様であり、離脱はA2A受容体のアップレギュレーションに必要ないことが示された。

本研究のもう一つの目的は、結合パラメータの変化が機能反応の変化と相関しているかどうかを調べることだった。 その結果、血小板凝集はアデニル酸シクラーゼの活性化と細胞内カルシウム濃度の上昇と関連していることがわかった。 カフェイン離脱後12時間、60時間、108時間におけるHE-NECAの効力は、対照群と比較して有意に増加した。 このことから、異なる用量のカフェインを繰り返し投与すると、血小板表面のA2A受容体の数が大きく変化し、受容体刺激に対する反応性が亢進することが示唆された。 古典的なアデノシンA2A受容体は、アデノシンおよびその類似体の抗凝集性に関与しており、これはA2A受容体欠損マウスでは凝集がより効率的になるという観察と一致する8。しかし、濃度の高いADPによって引き起こされる血小板凝集は、コントロールとカフェイン投与者の間で有意差はなかった。 この後者の観察結果に対する一つの可能な説明は、反応を引き起こすのに十分なアデノシンがアッセイ培地中に存在しないことである。 あるいは、カフェイン投与群では、受容体の増加の大きさ（すなわち、受容体の数）は、ADP誘発凝集の濃度-反応曲線のシフトを生じるには十分でなかったと考えられる。 しかし、心筋虚血時など内因性アデノシンの濃度が上昇した場合、アデノシンの細胞外濃度はアップレギュレートされた受容体に作用するのに十分なレベルまで急速に上昇し、コントロールよりも大きな血小板抑制効果を発揮する可能性がある。 したがって，平均的な食事摂取量からそれほど遠くない量のカフェインを慢性的に摂取すると，虚血時の血小板凝集能が逆説的に低下する可能性がある

結論として，すべてのデータを総合すると，カフェインの慢性摂取はアデノシンの作用に対する血小板の反応を変化させるというさらなる証拠が得られた． 本研究の主要な発見は，血小板機能に対する慢性的なカフェイン摂取の効果は，投与量および投与期間の両方に依存し，アデノシンA2A受容体のアップレギュレーションによる血小板凝集性の減少が根底にあるということである