減量とレニン-アンジオテンシン-アルドステロン系

肥満は高血圧と心血管リスクの上昇につながる1、2 レニン-アンジオテンシン-アルドステロン系 (RAAS) はいくつかの著者によって関与されてきた3。 ヒトでは、肥満の被験者で循環アンジオテンシノーゲン（AGT）、レニン、アルドステロン、アンジオテンシン変換酵素（ACE）活性の増加が報告された4-10。さらに、脂肪組織、特に肥満の齧歯類モデルでRAAS遺伝子発現増加が報告された3、11-15。脂肪組織AGT遺伝子発現と血圧の関連性は最近2つのマウスモデルで立証されている。 脂肪細胞における11β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ-1の標的発現は、野生型の遺伝的背景を持つマウスの血圧、血漿AGT、脂肪組織AGT遺伝子発現を増加させた17,18。肥満ヒトにおける血圧とRAASの関係は、ほとんどが観察研究であり介入研究からのものではなかった。 体重減少がRAAS活性、特にAGT血漿レベルや脂肪組織RAASに与える影響は調査されていない。

方法

施設審査委員会は両方の研究を承認した；すべてのボランティアはインフォームド・コンセントを書面で与えた。 横断的研究には38名の白人更年期女性が参加し，30名の更年期女性が減量プロトコールを開始し，17名が5％の体重減少目標を達成した。 糖尿病、肝疾患、うっ血性心不全、冠動脈疾患、微量アルブミン尿を有する者はいなかった。 ホルモン補充療法は4週間前に、その他の薬剤は試験の7日前に中止した。 減量中は併用薬の服用を禁止した。 両プロトコール前の3カ月間に体重が>1kg減少した被験者がいないように注意した。 腹部皮下脂肪組織サンプルは、臍周囲から針生検により採取した13。24時間外来血圧測定には適切なカフサイズを使用した（SPACELABS 90207）。 体重減少試験では、臨床評価の翌日から摂取エネルギーを 600kcal/d に減らすための食事指導と水中体操を開始した。 脂肪組織生検と臨床測定は、5％の体重減少が達成された後に繰り返された。 4日間の栄養日誌がつけられた。 減量試験の開始時と終了時に、外来血圧測定と並行して24時間尿を採取した。

先に詳述したように、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（PE Biosystems社、ドイツ、ヴァイターシュタット）のためにmRNAを分離・処理した13。 標的遺伝子 (AGT、レニン、レニンレセプター、ACE、アンジオテンシン II タイプ 1 レセプター) と内部コントロール遺伝子 (ヒトグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、GAPDH) は同一の RNA サンプルで標準曲線法を使用しました。 標的遺伝子の発現は、各サンプルにおけるGAPDHの発現で正規化し、任意の単位で表示した。 単離したヒト脂肪細胞におけるレニン受容体遺伝子の発現は、我々のグループによって検出されたものであり（データは示していない）、これまで報告されたことはない。 リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応に用いた配列は、フォワードプライマー、5′CCAGGACTCGCAGTGGTAA3′；リバースプライマー、5′CACTCCCTTCACCATCACCAT3′；蛍光ラベルプローブ、6-FAM-5′TGTTTCATCGTCCTGGCTACCG3′-TAMRA であった。 アッセイ間の変動係数は、GAPDHが1.8%、AGTが6.7%、レニンが6.4%、レニン受容体が3.1%、ACEが6.6%、AT1受容体が6.8%でした。

絶食血漿と血清は仰臥位で30分安静後に採取されました。 血清中のACE活性は、熱量測定法（Sigma Diagnostics, Deisenhofen, Germany）により測定された20。 血漿レニンおよび活性化プロレニン濃度は、免疫化学発光測定法（Nichols Institute Diagnostics, Advantage Direct Renin Assay, San Clemente, Calif.）により測定した。 血清アルドステロンは固相ラジオイムノアッセイ（DPC Biermann, Bad Nauheim, Germany）により測定された。 アッセイ間の変動係数は、AGTが3.4%、Ang IIが17%、ACE活性が7.2%、レニンが6.1%、そしてアルドステロンが5.6%だった。 すべての変数（mean±SD）は正規分布であった。 群間比較にはStudent t testを用いた。 ベースラインと体重減少のデータには、対のサンプルt検定が使用された。 Pearson coefficient of correlationは、変数間の関係を記述した。 結果は、P<0.05で統計的に有意とみなされた。

Results

表1は、横断的研究に参加した女性38人の臨床変数を示している。 空腹時のグルコース、インスリン、インスリン抵抗性のHOMA指数は肥満の被験者で上昇したが、糖尿病の範囲には入らなかった。 外来血圧と血中脂質はほぼ同じで、総コレステロールと低密度リポタンパク質コレステロールの値は両群でわずかに上昇した。 全身性RAASについては、肥満者ではAGT、レニン、アルドステロン、ACE活性の上昇がみられた（図1）。 脂肪組織では、AGT遺伝子の発現が肥満者で低下していたが、他の遺伝子の発現は痩せ型と肥満型の女性で差がなかった（図2）。

16週間以内に5％の体重減少を達成したのは30人中17人であった。 これらの女性は59±7歳で、13±2週間で5.6±1.0％の体重減少を達成した。 表2は、体重減少に伴う臨床変数、食事構成、電解質排泄量の変化をまとめたものである。 これらのデータは、横断的研究と減量研究の肥満女性が類似していることを示し、肥満と減量におけるRAASの系統的研究を可能にした。 身体測定変数の他に、収縮期日平均外来血圧測定、空腹時インスリン、HOMA指数の変化も観察された。 体重減少は、総食事量の減少によって達成されたが、食物組成に大きな変化は見られなかった。 ナトリウムとカリウムの摂取量および排泄量は、試験終了時に有意な減少を認めなかった。

体重減少により循環AGT、レニン、アルドステロンおよびACEのレベルが低下したことが認められた（図3）。 脂肪組織では，AGTの発現低下が認められた（図4）。 ベースラインと減量後の平均値の差は、減量の程度とAGT発現、循環血中AGT、レニン、アルドステロン、ACEの減少の程度との関係には反映されていなかった（ピアソン相関係数、データ示さず）。 しかし、体重減少は非特異的であり、一方、ウエスト周囲径の減少は内臓脂肪組織の減少の貴重な代用指標である。 我々は、AGT血漿レベルの低下とウエスト周囲径の間に、体重やBMIの減少とは無関係な非常に有意な相関を見出した（r=0.71；P=0.004；体重減少やBMIの減少で補正後；図5）。 さらに、循環血中AGTの減少は、脂肪組織におけるAGT遺伝子発現の減少と強い相関があった（図5）。 収縮期血圧の低下は、血漿AGT（r=0.61；P=0.006）および脂肪組織におけるAGT遺伝子発現（r=0.51；P<0.05）の両方と相関があった。

考察

痩せた閉経女性と比べて肥満のAGT、レニン、アルドステロンおよびACE活性レベルが高いことは、我々の肥満対象においてRAASが活性化していたことを示唆している。 この活性化は体重を5%減らすと減少し，それに伴って24時間外来血圧の収縮期が7mmHg減少した。 脂肪組織では、AGT遺伝子の発現が肥満女性で減少し、体重減少によりさらに減少した。 肥満であること以外に、すべての女性は健康であり、コレステロール値はわずかに上昇していた。 肥満による末端臓器障害の徴候や症状はなかった。

肥満における循環血漿中AGTレベルの上昇は以前から報告されている。21 我々はこの知見を確認し、肥満被験者のAGT血漿レベルの上昇は5％の減量により減少し、痩せた被験者のレベルに近いことが我々の知る限り初めて証明された。 さらに、体脂肪量減少の代用指標であるウエスト周囲径の減少は、体重減少そのものよりもAGT血漿レベルの減少をよりよく予測するものであった。 この知見は、動物実験で示唆されているように、脂肪からのAGT分泌がAGT血漿レベルの決定に関与しているかという疑問に直結する16,22。この疑問は、ヒトでの研究は困難である。 AGTは分子量が大きいため、マイクロダイアリシスは使用できず、脂肪組織におけるAGTの動静脈差も測定されたことはない。 代わりにAGTの遺伝子発現を研究したところ、相反する結果が得られた。

我々は、肥満被験者の皮下脂肪組織でAGT発現が減少していることを見出し、以前の結果を再確認した。13 肥満または高血圧の被験者の脂肪組織におけるAGTの発現レベルが低下または変化していないことも、他の研究者によって発表されている14,15,23 さらに、単離皮下脂肪細胞からのAGT分泌は、痩せたドナーと肥満のドナーで差がなかった24。 BMIの増加やウエスト周囲径の増加に伴い、皮下脂肪組織や内臓脂肪組織におけるAGT遺伝子の発現が増加したと報告したのは1グループのみである。16-18,22,25-27動物実験とは明らかに対照的に、ほとんどのヒト実験が肥満における脂肪組織AGT発現増加を支持していない。 減量後に脂肪組織のAGT発現が減少することは、これまで報告されていない。 脂肪細胞からのAGT分泌はよく知られているが、脂肪細胞以外の細胞タイプ（例えば、内皮細胞、リンパ球、単球／マクロファージ）が脂肪組織におけるAGT形成の減少に寄与している可能性を排除することができない。 さらに、我々の研究では、肝臓からのAGTの分泌が体重減少に伴って減少する可能性を排除できない。 しかし、動物のデータは、肝臓からのAGT分泌は肥満や体重減少の影響を受けないことを強く示唆している22,27

ヒトにおいて脂肪細胞が循環AGTレベルに寄与しているとすれば、脂肪組織量の増加自体が肥満におけるAGT血中濃度の上昇に十分であると考えられる。 脂肪細胞レベルでのAGT発現量の増加は必要条件ではない。 減量期に脂肪細胞でのAGT発現が減少することは、脂肪組織量の減少とともに、減量に伴う血漿AGTの減少に寄与している可能性がある。 本研究では、脂肪組織AGT発現量の減少と循環血中AGT濃度との間に強い関係が見いだされた。 従って、肥満者のAGT血中濃度が上昇する状況下で、脂肪細胞のAGT発現を制御する負のフィードバックループが存在することが示唆された。 体重減少が、脂肪組織でのAGT発現をさらに減少させる調節機構を付加している可能性がある。 そして、AGT血漿レベルの低下が、血圧の低下を促すと考えられる。 このモデルは、脂肪組織のAGTが全身循環に入るという仮定に基づいている。 マウスではこの状態である16

肥満におけるAGT発現を制御し、減量中にAGT発現を減少させる可能性のあるメカニズムは不明である。 ヒトや動物の脂肪細胞でAGT遺伝子の説得力のあるホルモン調節因子は同定されていない。3 体重と血圧の関係にはAGT遺伝子型の重要性が示唆された研究がいくつかある。28-31 これらの変異体（AGT-6, AGT-20, AGT174, AGT235）がどのようにしてAGT発現や血漿AGT値を制御する可能性があるかは不明である。 さらに、AGT235遺伝子型と肥満の表現型についても否定的な結果が得られている5,32。24 体重減少に関して、AGT-6遺伝子型は血圧の低下と関連していたが、体重減少そのものとは関連していなかった33。

我々のデータは、肥満の被験者でレニンとアルドステロンのレベルが高いことを確認している。8-10,34 レニンとアルドステロンのレベルの増加は、肥満の被験者は一般的にナトリウム貯留と容量拡大を呈するので、必ずしも期待できない35 腎交感神経系の過剰活動は、肥満のレニン放出を刺激するかも知れない36。 さらに、ヒト脂肪細胞の調整培地には、カリウムや AT1受容体の活性化とは無関係に、in vitroでアルドステロンの 分泌を増加させる生化学物質が含まれていた39 。 レニンの高値は、減量による血圧の低下を予測することが示されている42 が、我々の研究では、レニンまたはアルドステロンの低下と体重または血圧の低下との間に密接な関係は見られなかった（データは示されていない）。 肥満者においてレニンを増加させる可能性のあるメカニズムは、減量によって減少する43,44。減量した被験者において循環アルドステロンが減少するメカニズムはあまり明らかではないが、レニン活性の減少自体が、脂肪細胞産物と酸化脂肪酸誘導体の減少の可能性と同様に寄与している可能性が考えられる。 ナトリウムとカリウムの摂取量は減量期間中に変化しなかったので、関与していないと思われる。 減量によりレニンとアルドステロンが異なるメカニズムで減少する可能性がある。ベースラインのレニン値とアルドステロン値は高い相関があったが（r=0.75；P<0.01）、減量レベル以降は見られなかった。

肥満における高いACE活性と減量によるACE活性の減少は以前報告されている(5,40)。 さらに、DD遺伝子型は体重減少に対する血圧の感受性に影響を与えるが、体重減少量自体には影響を与えないことがわかった45。しかし、我々の研究では、体重減少によるACE活性の低下は血圧の低下と密接に関連していなかった（データは示していない）。 肥満マウスでは、腎臓のACE活性がエンドセリン受容体A型依存的に有意に上昇した46。その他の組織については、本研究では検討していない。

RAASの循環レベルは肥満被験者で上昇し、体重減少により減少したが、脂肪組織のRAAS遺伝子発現は、AGT遺伝子を除いて肥満や体重減少に影響を受けなかった。 この知見は、以前の結果と一致している13-15。もし、肥満におけるRAAS遺伝子制御の欠如が、脂肪組織における局所的なAng II産生に転化するとすれば、肥満における脂肪組織の代謝障害にとって、Ang IIの形成と作用の異常はそれほど重要ではないと推測される。 脂肪組織におけるマイクロダイアリシス法を用いた知見は、この推測を裏づけるものである47。マイクロダイアリシス法のデータは、今回紹介したデータと同様、皮下脂肪組織で得られている。 さらに、肥満によるいくつかの代謝性合併症は、BMIそのものよりも内臓脂肪組織の増加の有無と密接な関係があることが知られている48 。 しかし、皮下脂肪組織は全体脂肪量の約75％を占めている。 したがって、皮下脂肪組織における分泌タンパク質をコードする遺伝子の制御の変化は、重要な影響を及ぼす可能性がある。 臨床の場では、内臓脂肪組織の蓄積はウエスト周囲径を測定することによって判断される。 本研究におけるAGT血漿濃度の低下とウエスト周囲径の減少との密接な関係は、体重減少の条件下で内臓脂肪組織が皮下脂肪組織と同様の反応を示すという仮定を支持する。

Perspectives

肥満には循環RAAS (AGT, Renin, Aldosterone, ACE) の濃度上昇が関係していると考えられる。 これらの上昇したレベルは5％の体重減少により有意に減少した。 体重減少に伴い脂肪組織でのAGT発現が低下したことから，AGT血漿レベルと脂肪組織でのAGT遺伝子発現が関連しているという推測が支持される。 さらに、脂肪組織におけるAGTの発現および循環AGTの減少は、収縮期血圧の低下と相関していた。 これらのデータは，体脂肪量の減少が血漿および脂肪組織におけるRAAS活性を低下させる可能性を示唆しており，治療上重要な知見である。

脚注