成人ヒト心臓の細胞

データ報告

サンプルサイズを事前に決定するための統計的手法は用いなかった。

ドナー組織の研究倫理

心臓組織（ドナーD1-D7およびD11）はWellcome Sanger Institute（英国、ヒンクストン）で処理し、研究倫理委員会の承認（ref 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee）およびドナー家族からのインフォームドコンセントを得て、死亡移植器官ドナーより入手した。 心臓組織（ドナーH2-H7）は、Harvard Medical School（米国マサチューセッツ州ボストン）で処理され、ヒト研究倫理委員会の承認Pro00011739（カナダ、エドモントン、アルバータ大学）の後、死亡した臓器ドナーから入手された。 ドナー家族からのインフォームドコンセントは、機関内のヒト臓器調達・交換プログラム（HOPE）を介して取得した。 組織取得と処理

組織は英国および北米のドナー（D1-7および11、H2-7）から循環死（DCD）後（D2、D4-D7およびD11）および脳死（DBD）後（D1、D3、H2-H7）取得された。 英国のDCDドナーの場合、5分間のスタンディングオフの後、DBDの場合は開胸し、大動脈をクロスクランプして心臓のサンプルを取得する。 北米のDBDドナーでは、大動脈をクロスクランプし、大動脈から冷心筋麻痺（Celsior）を加圧投与して拍動を停止させ、心臓を摘出、冷生理食塩水で洗浄し、サンプルを取得する。 ドナーサンプルはすべて左右の心房、左右の心室、心室間膜、心尖部の全層心筋生検で、大きな心外膜脂肪沈着は意図的に除かれた。 単核分離に使用した試料は瞬間凍結し、-80℃で保存した。 単細胞の分離とCD45+の濃縮は、採取したばかりのサンプルで実施した。 核と細胞の分離手順の後に残った組織は、追加の研究のためにホルマリン固定またはOCTで凍結した。

すべての組織は、転写の劣化を最小限に抑えるために、凍結または組織の分離まで常に氷で保存および輸送された。 GTExコンソーシアムのバルク組織における死後組織の安定性に関する以前の研究68および単一細胞における研究69は、低温条件で保存した場合、死後最初の24時間以内の組織にはわずかな変化しかないことを示唆している。

Single nuclei isolation

Single nucleiは以前に記述したように機械的均質化を用いて瞬間冷凍組織から取得された70。 組織は、7mlのガラス製Dounce組織粉砕器セット（Merck）を用いて、ホモジナイズバッファー（250mM sucrose, 25mM KCl, 5mM MgCl2, 10mM Tris-HCl, 1mM dithiothreitol (DTT), 1× protease inhibitor, 0.5mM DTT）中で緩い乳棒（A）の8-10ストロークおよびきつい乳棒（B）の8-10ストロークを行い、均質化を行った。4 U μl-1 RNaseIn, 0.2 U μl-1 SUPERaseIn, 0.1% Triton X-100 in nuclease-free water)を添加した。 ホモジネートを 40-μm セルストレーナー（コーニング）で濾過した。 遠心分離（500g、5分、4℃）後、上清を除去し、ペレットを保存バッファ（1×PBS、4％ウシ血清アルブミン（BSA）、0.2U μl-1 Protector RNaseIn）中に再懸濁させた。 核はNucBlue Live ReadyProbes Reagents (ThermoFisher)で染色し、Hoechst陽性の一核はinflux、XDPまたはFACSAria (BD Biosciences) を用いた蛍光活性細胞ソーティング（FACS）で精製した（補足図1）。 核の精製と完全性は顕微鏡下で確認し、核はさらに製造者のプロトコルに従ってChromium Controller（10X Genomics）を用いて処理した。

単細胞の調製

心臓組織（0.2〜0.9g）を心筋液から酵素消化ベース液（100μg ml-1 liberase TH Research gradeおよび50μg ml-1 DNase I、HBSS 10 mM HEPESおよび30 mM taurine）を含むgentleMACS C-tubes (Miltenyi Biotec) に移し入れた71 。 組織は、ハサミ（FST）を用いてミンチし、ヒーター付きのgentleMACS Octo Dissociator（Miltenyi Biotec）を用いて自動的に消化した。 心筋細胞を除去した単細胞懸濁液を20％ウシ胎児血清（FBS）（Gibco）を含むベース液で洗浄し、70μmナイロンストレーナー（BD Falcon）でろ過し、遠心分離（330g、10分、4℃）により回収し、0.2％FBS（Gibco）を含むベース液に再懸濁させた。 各遠心分離後にトリパンブルー排除により細胞を3回手動でカウントし、少なくとも2×106 ml-1の濃度で再懸濁させた。 5399>

CD45+ cell enrichment

細胞懸濁液を上記のように調製し、続いて抗ヒトCD45モノクローナル抗体結合マイクロビーズを用いて、製造元のプロトコールに従って標識した（ミルテニ・バイオテック）。 簡単に言えば、最大107個の細胞を、20μlのCD45マイクロビーズを含む80μlのPBS、BSA、EDTA緩衝液（1×PBS pH 7.2, 0.5% BSA, 2mM EDTA）中で4℃において15分間インキュベートした。 細胞懸濁液をPBS, BSA, EDTA bufferで1回洗浄し、遠心分離（330g, 10分, 4℃）により回収した。 再懸濁した細胞をMACS LSカラム（Miltenyi Biotec社製）に適用した。 CD45-depleted細胞画分はPBS、BSA、EDTAバッファで3回洗浄後廃棄し、CD45+細胞画分はPBS、BSA、EDTAバッファで磁場からカラムを外すことにより回収した。 CD45+細胞を数え、PBS、BSA、EDTAバッファーに少なくとも2×106/mlの濃度に再懸濁した後、製造者のプロトコルに従ってChromium Controller (10X Genomics) を使用してさらに処理した。

Chromium 10X library preparation

単一細胞および核はトリパンブルー排除によって手動で数える、または少なくとも2つの別々のカウントを用いて Countess II (Life Technologies) を使用して自動的に数えることができた。 細胞または核の懸濁液は、1マイクロリットルあたり400～1,000個の細胞に調整し、1反応あたり4,000～10,000個の細胞または核の回収を目標としてChromium Controller (10X Genomics) にロードされた。 3′遺伝子発現ライブラリーは、v2またはv3のChromium Single Cell Reagent Kits (10X Genomics)の製造元の説明書に従って調製した。 cDNAと最終ライブラリの品質管理は、Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) または4200 TapeStation System (Agilent) を用いて行った。 ライブラリーは、Wellcome Sanger InstituteではHiSeq 4000（Illumina）を、Harvard Medical SchoolではNextSeq 500（Illumina）を用いて、細胞または核あたり最低20,000-30,000リードペアの深度で配列決定した（補足表22）。

Spatial validation using smFISH with RNAscope probes

ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）サンプルの準備中、新鮮組織は中性緩衝10％ホルマリンで18～36時間固定し、その後パラフィンブロックに包埋されました。 固定凍結した組織サンプルは、4％パラホルムアルデヒド（ThermoFisher）で固定した。 ミクロトームを用いて5-μmの厚さで切片を切り出し、SuperFrost Plusスライド（VWR社）に載せた。 FFPE組織スライドは、BOND RX（Leica）とRNAscope Multiplex Fluorescent Kit v2 Assay（ACDBio）を用いて、メーカーのプロトコールに従って自動染色を行った。 固定凍結した組織スライドは、RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio)のプロトコルにしたがって処理した。 RNAscope の既製またはカスタムメイドの標的プローブを、多重陽性および陰性対照に並行して実行した（拡張データ図 12b、補足表 23）。 すべての核はDAPIで染色した。 すべてのFFPE組織スライドは、1-μmのzステップサイズおよび20×水浸対物レンズ（NA 0.16、0.299μm/ピクセル）を有するOpera Phenix High-Content Confocal Screening System（Perkin Elmer）を用いて画像化した。 チャンネル。 DAPI（励起375 nm、発光435-480 nm）、Atto 425（励起425 nm、発光463-501 nm）、オパール520（励起488 nm、発光500-550 nm）、オパール570（励起561 nm、発光570-630 nm）、オパール650（励起640 nm、発光650-760 nm）. 固定凍結した組織スライドは，LSM710共焦点顕微鏡（Zeiss）と40×油浸対物レンズ（1.3 oil, DIC III）を用いて画像化した． チャンネルを DAPI（励起375 nm、発光435-480 nm）、Alexa Fluor 488（励起492 nm、発光517 nm）、Ato 550（励起560 nm、発光575 nm）およびAto 647（励起649 nm、発光662 nm）。 可視化およびバックグラウンド除去（ローリングボールラジアス）はFiji/ImageJ72を使用した。

Haematoxylin and eosin staining

組織サンプルは-80℃のisopentane (ThermoFisher) で新鮮凍結し、OCT (VWR) に包埋した。 切片はミクロトームを用いて10μmの厚さで切断し、SuperFrostPlusスライド（VWR）に載せ、標準的なヘマトキシリンおよびエオシン染色プロトコルに従ってさらに処理した（拡張データ図12a）＜5399＞＜2074＞骨格筋組織の取得＜2209＞＜7881＞肋間筋サンプルは左側の第2および第3肋間の間で取得した。 これは通常、筋肉の最も深い層（皮膚から最も離れている）からです。

Nuclei isolation for skeletal muscle

筋肉組織を1×PBSで洗浄し、目に見える脂肪沈着を取り除き、約1mm3の断片を得るためにミンチにした。 サンプルあたり、約0.3gのミンチした組織を3mlの緩衝液A（250mMスクロース、10mg ml-1 BSA、5mM MgCl2、0.12U μl-1 RNaseIn, 0.06U μl-1 SUPERasIn, 1× protease inhibitor）中でDounce tissue grinder set (Merck) を用いて緩い乳棒（A）の50ストロークで均質化させた。 このホモジネートを 100-μm cell strainer (Corning) で濾過し、1ml のバッファ A で洗浄した後、750μl のバッファ A を加え、Triton X-100 (最終濃度 0.5%) を加えた後、さらに乳棒 50 回で均質化した (B)． 40-μmストレーナーでろ過した後、核を遠心分離し（3000g、5分、4℃）、1mlの緩衝液Bに再懸濁した（320mMショ糖、10mg ml-1 BSA、3mM CaCl2、2mM酢酸マグネシウム、0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× protease inhibitor, 0.12 U μl-1 RNaseIn, 0.06 U μl-1 SUPERasin）、27% Percoll gradient solutionを用いて精製した。 Percoll混合液を20,000gで遠心分離し（15分、4℃）、ペレットを200μlのBuffer Bに再懸濁し、遠心分離を行った（20,000g、3分、4℃）。 トリパンブルー染色後、ヘモサイトメーターを用いて無傷の核を数えた。 核のプロファイリングは、Chromium Controller (10X Genomics) を用いて、メーカーのプロトコールに従って行った。

Single-cell isolation for skeletal muscle

筋肉組織を1×PBSで洗浄し、目に見える脂肪沈着物を除去して細かくミンチ状にした。 次に、ミンチした組織の2gを消化バッファ1（1×PBS中750U ml-1 collagenase type 2）に移し、ウォーターバスで37℃、90分間インキュベートした。 部分的に消化された組織を遠心分離（650g、5分、4℃）により集め、ペレットを消化バッファ2（100U ml-1 collagenase type 2、2U ml-1 dispase in PBS）中に再懸濁させた。 水浴中37℃で30分間インキュベートした後、2％FBSの添加により消化を停止させた。 細胞を100-μmと40-μmのナイロンストレーナー（BD Falcon）でろ過し、遠心分離（650g、4℃、3分）で回収し、1×PBS、2％FBSで洗浄した。 その後、20% Percoll gradient (15,000g, 4 ℃, 20 min)で細胞精製を行った。 細胞を含む層を回収し、2%FBSを含むPBSで洗浄した後、血球計数装置を用いてトリパンブルー排除により生細胞を計数した。 核は、製造元のプロトコルに従って、Chromium Controller（10X Genomics）を使用してプロファイリングした。

Methods key resources tableは、補足表24にある。

Transcriptome mapping

配列決定後、サンプルを脱多重化し、CRAMファイルとして保存した。 各サンプルは10X Genomicsが提供するヒトリファレンスゲノム（GRCh38 v.3.0.0）に、CellRanger suite（v.3.0.1）によりデフォルトパラメータでマッピングされた。 単一細胞サンプルは、提供されたリファレンスに対してマッピングされました。 Single-nuclei samples, pre-mRNA のリファレンスは、10X Genomics の説明書 (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references) を用いて作成しました。

Count data processing

マッピング後、各データソース (single nuclei, single cell, CD45+ cell) からのサンプルは raw_feature_bc_matrix_h5.h5 を連結して個々のAnnDataオブジェクトにまとめ、適切なメタデータ情報を付加しています。 各データソースオブジェクトについて、ユニーク分子識別子（UMI）の平均値（n_counts）を算出し、空滴の閾値として用いた。

Doublet detection

空滴を除去した後、scrublet73を適用して各細胞にdoublet score（scrublet_score）を割り当てた。 これらの細胞はUMAP法74を用いてクラスタリングし、可視化した。 さらに、各細胞は、ダブレットの検出を改善できるように、パーコレーション法を使用してダブレット検出のために処理された75。

細胞の品質管理とフィルタリング

ソース固有の品質の違いを考慮して、各データソースは別々に処理および注釈が付けられた。 これらのメトリックは、さらなる処理のための共変数として含まれています。 総細胞およびCD45+細胞は、カウント（500 < n_counts <15,000） 、遺伝子（200 < n_genes）、ミトコンドリア遺伝子（ percent_mito <20% ）、リボソーム遺伝子（ percent_ribo <20%）および scrublet score（scrublet_score <0.3 ）でフィルタリングされました。 一核はcounts (500 < n_counts <15,000), genes (300 < n_genes <6,000), mitochondrial genes (percent_mito <5%), ribosomal genes (percent_ribo <5%) and scrublet score (scrublet_score <0.3) でフィルタリングされました。 骨格筋のデータセットにも同じフィルタリングのしきい値を適用した。.7を使用して、正規化（normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10,000）、ログ変換（log1p）、可変遺伝子検出（highly_variable_gene）、不要な変動源の除去（regress_out：n_counts and percent_mito）、データ特徴のスケーリング（scale： max_value = 10）およびPCA（pca：高変動遺伝子を使用）などのダウンストリーム解析は既出77と同様に実施された。

Batch alignment using deep variational autoencoder

データ中のすべてのデータソースとドナーをアライメントして、グローバルマニフォールドを構築しました。 これは3段階の手順で行われた。 (1)各データソースは別々に分析され、アノテーションされ、bbknn78で一括アライメントする前に、周皮空間線形回帰ステップを使用してドナーのみアライメントされた。 (1)各ソースを別々に解析し、ドナーのみを周皮細胞空間線形回帰ステップでアライメントした後、bbknn78で一括アライメントを行った。 (2) 各クラスタのアノテーションは、ToppFun79およびEnrichR80データベースに対してlogFC >1 で有意な上位DEGs (P < 1 × 10-5) を検索し、統合的アプローチを採用した。 パスウェイ、転写制御、生物学的プロセスに関する有意なヒットは、与えられたクラスターを注釈するために優先された。 各細胞コンパートメントは、ソース固有の細胞状態をグループ化した後、adata.obs スロットの下でラベル付けされた。 (3) すべてのソースを 1 つの AnnData オブジェクトに統合し、adata.obs というラベルで表示した。 バッチは scGen 変分オートエンコーダ81 の batch_correction 関数を用いて整列させた。 まず、adata.obsをアンカーとして、adata.obsについてアライメントを行う。 次に、adata.obsをアンカーとして、adata.obsに対してアライメントを行った。 各バッチアライメントラウンドは50エポック実行した。

この方法で脂肪細胞、血管、免疫心集団、および骨格筋解析のマニフォールドを作成し、SCCAF82でクラスタリング精度を評価した(Extended Data Fig. 5399>

DEGs

各細胞コンパートメントの亜集団のアノテーションを助けるために、scanpyワークフローに実装され、最近のベンチマーク研究83で推奨されているWilcoxon rank sum testを用いてDEGsを計算する。 また、遺伝子は、解析セクションで特に明記しない限り、log2変換したfold change > 1とP < 1×10-5を有する場合、差次的に発現しているとみなされた。

Cell-cell interactions

研究中の集団の発現マトリクスを、インデックスとして細胞バーコードを含むメタデータテーブルと共にAnnDataからエクスポートした。 Cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60のように、CellPhoneDBを実行した。 CellPhoneDBのraw predictionsは、P > 1.0 × 10-5の相互作用を除去することでフィルタリングされた。 また、有意なペアをReactomeDB、enrichR、ToppFunで遺伝子セット濃縮解析を行い、機能分類を行った。 血管細胞は解析前に39,000個、心臓修復群（心房・心室心筋細胞、FB、免疫細胞）は解析前に69,295個にランダムサブサンプリングされた。

10X Genomics Visiumデータにおける遺伝子発現の可視化

10X Genomicsから公開されている左心室心筋のVisiumデータ（https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart）をScanpy v.1 で処理しました。.5ワークフローを10X Genomics Visiumデータの解析に適応させた（https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html）。 簡単に言うと、500 UMI未満、または20,000 UMI以上、および200遺伝子未満のスポットが削除された。 データはプロット前に対数変換し、正規化した。

Estimation of RNA velocity

単一細胞およびCD45+濃縮単一細胞のRNA速度を算出するために、CellRanger出力BAMファイルとGENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) ファイルとvelocyto84 CLI v.0.17.17 とともに用いて、スプライスとアンスプレーRNAを定量したものを含むルーンファイルが生成された。 次に、scVelo85を用いてマニフォールドを構築し、細胞をクラスタリングしてRNA速度を可視化した。

Subpopulation analyses of atrial and ventricular cardiomyocytes, FBs and neuronal cells

グローバルオブジェクトで心筋細胞、線維芽細胞、神経細胞としてラベルされたすべてのバーコードはさらなるサブ集団解析の対象に選ばれました。 心筋細胞数 (n_counts <12,500), 遺伝子 (n_genes <4,000), ミトコンドリア遺伝子 (percent_mito <1%), リボソーム遺伝子 (percent_ribo <1%), scrublet score (scrublet_score <0.) という細胞集団固有のフィルター基準を核に対して追加で適用した。25）；FBミトコンドリア遺伝子（percent_mito <1%）、リボソーム遺伝子（percent_ribo <1%）；神経細胞遺伝子（n_genes <4000）、ミトコンドリア遺伝子（percent_mito <1%）、リボソーム遺伝子（percent_ribo <1%）を算出した。 心房および心室の心筋細胞データセットでは、TotalおよびCD45+細胞は除外され、サブポピュレーション解析に寄与しなかった。 FBsまたは神経細胞のtotalおよびCD45+細胞のさらなるフィルタリングは適用されなかった。 心筋細胞およびFBは、さらに発生部位に基づき2つのグループに分けられた。 (1) 左心房と右心房、および (2) 左心室と右心室、心尖、心室間中隔。

ドナーの影響は、上記のステップ (1) で説明したように整列されました。 FBと神経細胞については、上記手順(3)のようにソースを整列させた。 ライデンクラスタリングとUMAPによる可視化を行い、亜集団の特定と可視化を行った86。 差次的発現遺伝子は、Wilcoxon rank sum test を用いて算出した。 心筋免疫集団と骨格筋、腎臓、血液免疫集団の組織間比較

成人腎臓の単細胞トランスクリプトームデータを文献から収集した。 99 (https://www.kidneycellatlas.org/) から成人の腎臓の単一細胞トランスクリプトームデータを収集し、彼らの研究で報告されたすべての免疫細胞をサブセットしました。 SKMについては、マージされた多様体から注釈付きの免疫細胞を選択した。 ヒト血液については、10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3) が提供する一般に公開されている10,000シングルPBMCセルデータセットを使用した。 先に述べたように87、我々は心臓の免疫細胞について、発現データの80％を用いてロジスティック回帰モデルを訓練し、残りの20％でその精度を検証し、0.6862の精度のモデルを作成した（拡張データ図8f、補足の表16）。 次に、このモデルを、成人の腎臓、SKM、PBMCにおけるアナログ心筋免疫集団の予測に適用した。 0.8未満の確率の予測は、下流の比較分析から除外した。

Gene Ontology enrichment analysis

心室心筋細胞集団については、vCM4のスコアランク遺伝子リストを入力として、RパッケージgProfileR（https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html）を用い、心室心筋細胞で発現する遺伝子群をバックグラウンド（UMIカウント>1の遺伝子）として、使用した。 血管細胞のGene Ontology解析を行うために、対数変換したfold change > 1を持つ上位500個の有意なDEGを、ToppFun79を用いてGene Ontology biological processデータベースに対して検索した（Supplementary Table 25）。 各サブポピュレーションで有意に濃縮された上位5語（q < 0.05）を選択し、ヒートマップにプロットした。 脂肪細胞のパスウェイ解析を行うために、上位500個の有意なDEG（P < 1 × 10-5）を対数変換したfold change > 0.5でToppFun79パスウェイデータベースに対して検索した（補足表26）。 5399>

Gene set score

Oncostatin M経路に関与する遺伝子の濃縮度を計算するために、scanpyに実装されたscore_genes関数を使用した。 遺伝子一覧は文献調査により収集した88,89。 遺伝子セットの濃縮では、ノイズを減らすために高発現遺伝子のみを考慮した（全細胞で500 UMI以上）。 心筋免疫細胞については、心筋内在性マクロファージ51、マウス組織再形成マクロファージ45、卵黄嚢系由来の先行研究の観察結果と比較するために同様の解析を行った90。 各部位の細胞型分布の比較にはStudentのt検定を使用した。 P < 0.05を統計的に有意とした。 線形回帰モデル（相関関係）は、線形関係の統計的尤度（P値）を推定するR線形モデル関数（lm）を用いて求めた。 多重検定にはボンフェローニ補正を適用した。

図中に描かれているRNAscopeの顕微鏡写真は代表的なものである。 図2g、3c、hおよび拡張データ図3c（HAMP）、拡張データ図3e（CNN1）、拡張データ図4g、m、6fの顕微鏡写真は、2つの個々の組織切片で同様の結果が繰り返されたものである。 Fig. 2h, 3f と Extended Data Fig. 3c (CNN1), Extended Data Fig. 3e (PCDH7), Extended Data Fig. Fig. 1e, 2d, 3e および Extended Data Fig. 1f, 3c (FHL1), Extended Data Fig. Fig. 2c and Extended Data Fig. 3c (PRELID2), Extended Data Fig. 10e, 12a の顕微鏡写真は、6つ以上の個々の組織切片で同様の結果を得た上で繰り返された。 ポジティブコントロールとネガティブコントロールは、使用したサンプルごとに1回行った。

GWAS enrichment analysis

GWAS summary statisticsをbroad cvdi、EBI GWAS catalogue、GWAS atlasからダウンロードした。 パワーがあるGWAS（n＜731＞5,000、有意な遺伝子座の数＜731＞10）を持つ形質を選択した。 GWASデータセットは、補足表27にまとめてある。 タンパク質遺伝子の遺伝子発現データはEntrez遺伝子IDにマッピングし、これらの遺伝子アノテーションはヒトゲノムアセンブリhg19/37で使用された。 核の遺伝子発現データのみを使用した。 この解析は、pythonとRで以前に記述された64を実装した。対数変換されたカウント（プラス1擬カウント）は、平均的な細胞タイプ固有の発現プロファイルを計算するために使用された。 各細胞型について、常にデフォルトの遺伝子レベルの共変量（例えば、遺伝子長）と全細胞にわたる平均遺伝子発現を条件として、個別のマグマ解析を実施した。 その後、Benjamini-Hochberg法を適用し、FDR < 10%の細胞型形質相関を選択した。 これらのペアを、以前に記述された64のように条件分析にかけ、関連性の「独立」、「共同説明」、「部分的に共同説明」のペアを定義した（補足表28）。

分散細胞と単離核の分布

単離核と分散細胞を得るための異なる手順により、細胞タイプの分布は著しく異なるものになった（補足表29、拡張データFig.2）。 特に、分離核の30.1％および49.2％は心房および心室領域の心筋細胞由来であったが、これらの細胞は分離細胞およびCD45選択細胞の調製物からほとんど除外された（補足表2）

心筋細胞を除外しても、分離核および分散細胞から特定される細胞型の分布は異なるままであった（補足表30）。 分散細胞の59.0%はECであったが、核の15.7%のみがECに由来していた。 一方、核の64.2％はFB（31.2％）および周皮細胞（33.0％）由来であったが、分散細胞の17.1％はFB（2.3％）および周皮細胞（14.8％）だけであった。 これらの違いは、分離手順に対するEC核の感受性、あるいは細胞酵素消化に対する周皮細胞およびFBsの抵抗性を反映していると考えられる。

分離核と分散細胞の細胞分布に違いはあるものの、細胞系列の遺伝子発現プロファイルは合理的に相関していた（各細胞型についてr > 0.4 ）。 細胞と核で捉えられた遺伝子の一致に対処するため、図1cの主要な細胞型マーカーの発現を3つのソースで比較した（Extended Data 図1c）。 核には細胞質RNAがないため、特定の遺伝子、特に免疫遺伝子NKG7とC1QAの発現は、細胞よりも核で低くなっていた。 しかし、マーカー遺伝子に関する一般的な傾向は3つのソースで一貫しており、同じ遺伝子がソースとは無関係に個々の細胞タイプを区別していた。

血管細胞のさらなる解析

PC3_strには細胞と核が同様に寄与し、scrubletスコアは使用した厳しい閾値を下回った。それでもこのクラスターの平均遺伝子数とカウントは平均より高かった。 このため、厳密な品質フィルタリングを行ったにもかかわらず、このクラスターにダブレットが存在する可能性を排除することができない。 EC10_CMC-likeとPC4_CMC-likeはECまたは周皮細胞遺伝子と心筋細胞マーカーを共発現しており、それらがこれまで知られていなかった細胞状態またはdoubletsを表しているかどうかを理解するためにはさらなる研究が必要となる。

動脈および静脈SMCの観察は、動脈SMCはより収縮性が高く、静脈SMCは分化度が低いと予測したこれまでの研究によって裏付けられている91。

EC3_capは、VEGF、炎症およびストレスシグナルへの応答を含む複数のEC運命決定を仲介するAP1のコンポーネント（JUNおよびFOS）、および多様なシグナルによって誘導される適応応答遺伝子であるATF3をコードする転写物を豊富にする92，93，94．

骨格筋の特性評価

我々は、一致する心臓組織を持つドナー1人を含む5人の健常者から肋間骨格筋サンプルを収集し、35,665の単一細胞および39,597の単一核のトランスクリプトームをプロファイリングしました。 心臓と同様に、細胞と核の組み合わせにより、心筋細胞、線維芽細胞、内皮細胞、平滑筋細胞、周皮細胞、骨髄系およびリンパ系免疫細胞、衛星細胞などの主要な細胞系統を捕らえ、特定することができた（拡張データ図11a、b、補足表31）

骨格筋の血管細胞についてさらに解析すると、10の異なる集団を特定することができた。 内皮細胞は、心臓で観察されるものと同様のシグネチャーを持つ、それぞれの血管床に基づいた分離した5つのクラスターを示した。 EC_capはVWFとRGCCを発現している。 骨格筋と心筋の血管と間質細胞集団の全体的な分布は、ECの動脈と静脈の特徴を含めて類似していたが、骨格筋には単一のSMCクラスターがあり、データセットのサイズが小さいことに関係していると思われた。 骨格筋では、EC_artとSMCの予測される細胞間相互作用には、NOTCH1/4-JAG1、JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3が含まれるが、心臓で推定されたJAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2は含まれていない（拡張データ図11e、f、補足表33）。

心臓免疫細胞

ロジスティック回帰モデルを用いて、SKMまたは腎臓における心臓IL17RA+単球の対応物は、おそらくこの集団のサイズが小さいことに起因して、同定できなかった。 メモリーT細胞（CD8+T_tem）はBACH2、STAT4、IL7Rを発現し、長期免疫記憶と関連していた96,97. さらに、scNym98を用いてリンパ系細胞の特徴を調べ、公表されているデータを用いてトレーニングを行った99,100。 その結果得られたモデルを心臓の免疫細胞に適用し、予測スコアが0.8以上の細胞を再アノテーションの候補と推定した。 この手法により、プラズマB細胞（109）、樹状細胞（645）、自然リンパ球（89）、MAIT T細胞（219）、Tヘルパー細胞（80）T制御細胞（11）、T中枢記憶細胞（103）、γδT細胞（30）、プラズマサイトイド樹状細胞（27）についての候補が確認されました。 これらの注釈は、www.heartcellatlas.org の ‘scNym’ というラベルの下にある cardiac immune object annotations で見ることができます。

Reporting summary

研究デザインに関するさらなる情報は、この論文にリンクされている Nature Research Reporting Summary で見ることができます。