ペレグリノは1999年11月に「X-ファイル」のシーズン7、エピソード3に出演。 2001年、デヴィッド・リンチ監督の『マルホランド・ドライブ』で無能な殺し屋を演じ、ショータイムの『デクスター』ではリタの虐待する前科者の元夫ポールを、その後『スーパーナチュラル』のルシファー役、ABC『LOST』の謎の不死身ヤコブ役で主演を務めている。 また、テレビシリーズ「Northern Exposure」「ER」「Without a Trace」「NYPD Blue」「CSI: Crime Scene Investigation」「ナイトライダー」に出演。
カルト映画「The Big Lebowski」では、The Dudeの頭をトイレに詰め、ボーリングのボールを落として床のタイルを破壊する「ブロンド・サグ」役で出演。 ナショナル・トレジャー』では、ジョンソン捜査官と呼ばれる背景のFBI捜査官として登場した。 また、「The Beast」では、爆弾魔のボビー・ジェームズを演じた。
2009年3月、ペレグリノはABCシリーズ「LOST」のシーズン5の最終回に出演し、謎の男ジェイコブを演じた。 また、2009年6月26日には、CWの「スーパーナチュラル」の第5シーズンにルシファー役で出演することが発表された。 第7シーズンではレギュラー役、第12、13シーズンではメイン役を演じた。 シーズン14ではルシファーの器であるニック役でメインを務め、シーズン15では特別ゲストとして出演した。
Mark Pellegrino at Calgary Expo 2015
SyFyホラーシリーズ「Being Human」では第1シーズンでヴァンパイア「ビショップ」役を演じ、シーズン2、3でもフラッシュバックと幻覚で再演している。
2015年、ペレグリノはABCのスリラーシリーズ「クワンティコ」に参加し、FBI副長官クレイトン・ハース役でレギュラー出演。
ペレグリノは、2018年の大ヒットゲーム「ファークライ5」で敵役のひとり、ジェイコブ・シード役の声優としても登場、ビデオゲームで初の役となった。
ペレグリノが演じるのは、このゲーム。