Results and Discussion
VARV Genome Stability and Phylogenetic Analysis.
La disponibilità di sequenze del genoma di una collezione di isolati VARV con un’ampia distribuzione geografica (Fig. 1) è stata utilizzata per lo studio evolutivo del VARV (4). VARV, un membro del genere Orthopoxvirus, contiene un singolo genoma lineare di DNA a doppio filamento di 186 kb che codifica la maggior parte degli enzimi per la sua propagazione (5). Gli isolati VARV studiati hanno dimostrato un basso tasso di mutazione perché gli isolati epidemiologicamente collegati hanno mostrato pochi o nessun cambiamento di sequenza in campioni con tempi di raccolta fino a 1 anno di distanza. Questo basso tasso di mutazione può essere chiaramente visto nei nostri campioni geneticamente identici del Bangladesh raccolti tra il 1974 e il 1975. Questi campioni rappresentano certamente lunghe e complesse catene di trasmissione da una delle regioni più densamente popolate del mondo, ma hanno sequenze nucleotidiche identiche o quasi identiche. Il virus correlato Orthopoxvirus monkeypox mostra analogamente singoli o nessun cambiamento nucleotidico tra isolati da tre diversi ospiti in un recente focolaio negli Stati Uniti (6). All’interno e tra le specie di orthopoxvirus, i genomi possiedono identità nucleotidiche di >99.6% tra gli isolati VARV e 98% tra VARV e taxa congenerici come il virus taterapox (TATV) (4) (Africa occidentale) e il virus camelpox (CMLV) (7) (Asia centrale) (Tabella 1), due specie con la massima somiglianza di sequenza a VARV (4). Le grandi dimensioni e il lento tasso di sostituzione nucleotidica permettono al DNA genomico del VARV di conservare mutazioni filogeneticamente informative, abbassando l’incidenza delle mutazioni omoplastiche (cioè, meno inversioni di stato dei caratteri). La diversità dei 47 genomi VARV recentemente sequenziati era in gran parte associata all’origine geografica degli isolati (rif. 4 e questo studio), e le mutazioni avevano una minima associazione con la variazione temporale tra gli isolati. Queste osservazioni dimostrano che non c’era un singolo ceppo pandemico ( SI Text , Nota 1) ma piuttosto che i cladi genetici di queste analisi sono rappresentativi di vecchi e forse antichi ceppi localmente endemici.
Ipotesi sull’origine del VARV. Evento 0, L’alta somiglianza di VARV alle sequenze del genoma di CMLV e TATV suggerisce che TATV e CMLV condividono un antenato comune più recente con VARV rispetto ad altre specie note di Orthopoxvirus. Evento 1, ipotesi A: Un VARV ancestrale diverge in due cladi primari (P-I e P-II) e si evolve indipendentemente nel Vecchio e nel Nuovo Mondo seguendo i suoi ospiti umani. Evento 1, ipotesi B: La divergenza di P-I/P-II in Africa. Evento 2, ipotesi A e B: Il lungo ramo singolo e la successiva radiazione di P-I suggeriscono che il VARV ancestrale di P-I ha probabilmente avuto origine nel nord-est dell’Asia e che gli endemici del vaiolo di P-I hanno iniziato a diffondersi in Asia orientale, Medio Oriente e India quando le popolazioni locali sono diventate sufficientemente grandi. Evento 2a, la diversificazione e la migrazione di P-I in tutta l’Asia. Evento 2b, l’esplorazione occidentale portò il VARV maggiore in Sudafrica dal subcontinente indiano, che poi si diffuse verso nord in Africa centrale e nel Corno d’Africa (penisola somala). Eventi 3 e 4, ipotesi A: la diversificazione del P-II nel Nuovo Mondo seguita dalla sua reintroduzione in Africa; ipotesi B: La diversificazione di P-II in Africa, seguita dalla successiva introduzione di una sottoclade nel Nuovo Mondo.
Se la radiazione P-I rappresenta la storia endemica del vaiolo nel Vecchio Mondo, si spiega il puzzle storico riguardante l’assenza di una descrizione del vaiolo nella letteratura delle antiche civiltà greca e romana (1). È probabile che le epidemie di vaiolo in questa regione siano avvenute in un momento successivo a quelle dell’antica Cina e dell’India. La “peste di Atene” del 430 a.C. descritta da Tucidide, una volta considerata come vaiolo (3), contraddirebbe questa teoria, ma è stato recentemente stabilito che si trattava di febbre tifoidea (25). Durante il regno di Ramses V, l’Egitto era in una guerra civile ed era attaccato da nemici dal nord (3); se l’eruzione pustolosa di Ramses V era da vaiolo, potrebbe rappresentare un’epidemia di vaiolo da casi importati a causa della guerra piuttosto che una malattia endemica regionale. Questa ipotesi è supportata dal fatto che solo tre mummie in quel periodo avevano lesioni simili (2).
Diversificazione dell’Alastrim minor.
Le analisi basate sulla topologia della storia del vaiolo/VARV mostrano che la divergenza dell’alastrim minor e della variola dell’Africa occidentale è iniziata almeno 800 anni fa (Tabella 2 e Tabella 4 SI), precedendo la precedente ipotesi che questa divergenza coincida con l’inizio della tratta degli schiavi. Secondo l’ipotesi di origine più antica, questa divergenza potrebbe essersi verificata dopo un evento di speciazione nel Nuovo Mondo (in base alla calibrazione dai primi record storici del vaiolo; Fig. 3 A) o in Africa occidentale (in base alla calibrazione dai record storici del vaiolo sudafricano; Fig. 3 B). Questi scenari suggerirebbero che c’erano isolati non identificati di variola minor/alastrim che esistevano in Africa o nel Nuovo Mondo molto prima della scoperta dell’alastrim minor (P-II); quindi, questo taxon ha una storia più lunga di quanto sia stato descritto.
Anche se l’importazione ben documentata del VARV major nelle Americhe ebbe un effetto devastante su molte delle popolazioni native (2), le registrazioni della rapida diffusione della malattia con grande mortalità potrebbero, in parte, essere attribuibili all’effetto combinato dell’alta densità di popolazione, della mancanza di cure di base per le vittime e delle potenziali coinfezioni con altre malattie del Vecchio Mondo (26, 27). Storicamente, ci sono poche registrazioni di vaiolo in Africa occidentale, e Henige (28) ha sostenuto che il primo grande focolaio di vaiolo VARV nel Nuovo Mondo non ha avuto origine dall’Africa occidentale, il che confuterebbe l’ipotesi di una storia precoce di vaiolo in Africa occidentale. È possibile che dopo un’antica introduzione, l’alastrim si sia evoluto indipendentemente in regioni isolate all’interno della grande area geografica del Nuovo Mondo. Infatti, lo studio di Phelan ha dimostrato che le popolazioni native degli altipiani dell’Ecuador non sono diminuite durante l’iniziale dominio spagnolo (a cui si attribuisce l’introduzione del VARV major nel Nuovo Mondo) (29), suggerendo che queste popolazioni potrebbero essere state più resistenti al vaiolo, forse per un precedente contatto con l’alastrim. A Trinidad, è stato documentato che un leggero focolaio di vaiolo nel 1902 ha avuto origine da questa regione (30). Se questa diversificazione è avvenuta nel Nuovo Mondo, allora l’evento primario di isolamento sarebbe probabilmente derivato dal movimento di un VARV ancestrale con i primi esseri umani in quella regione (Fig. 4A). L’assenza di firme SNP suggestivi di miscelazione tra P-I e P-II (SI Figg. 6 e 7), le caratteristiche cliniche coerenti e significativamente diverse di alastrim da VARV tradizionale maggiore di P-I (31), potrebbe essere spiegato da una tale significativa separazione geografica.
Se la scissione di P-I/P-II si è verificato all’interno del Vecchio Mondo, P-II probabilmente origine in Africa occidentale. Le due sottocladi P-II si sarebbero poi separate ≈800-1.100 YBP (Tabella 2 e Tabella 4) nel continente africano. Le distribuzioni geografiche di questi eventi sono difficili da determinare a causa della mancanza di storia scritta in queste regioni. Tuttavia, la presenza e la diversificazione di altri Orthopoxvirus strettamente correlati come il monkeypox e il TATV potrebbero sostenere un’origine africana per i VARV ancestrali. Se l’isolamento e la diversificazione di P-II sono avvenuti in Africa, allora, sulla base della nostra filogenesi, c’è un rappresentante africano non descritto della sottoclade P-II, che è stato introdotto nel Nuovo Mondo forse centinaia di anni dopo l’evento di diversificazione, forse durante il periodo della tratta degli schiavi tra i paesi del Vecchio e Nuovo Mondo (Fig. 3 B).
Un’inadeguata comprensione della storia di queste culture e i sintomi clinici relativamente più lievi (rispetto alla variola major) contribuiscono all’assenza di una più ampia documentazione storica di malattie da vaiolo nel Nuovo Mondo o nell’Africa sub-sahariana. Le densità storiche della popolazione umana in entrambe queste regioni erano inferiori alle regioni con variola major endemica. Nei casi di malattia più lieve, gli individui sarebbero stati più mobili quando erano infettivi e avrebbero avuto un maggior numero di contatti, perpetuando così la diffusione della malattia. A sostegno di questa ipotesi, i lievi focolai di vaiolo in Somalia persistevano per lunghi periodi tra piccole bande nomadi e mostravano un modello di trasmissione significativamente diverso rispetto a quello del VARV major (2). Sebbene non sia noto se la pratica della variolazione/inoculazione fosse usata dai popoli indigeni dell’Africa o delle Americhe, la longevità del VARV all’interno delle croste convalescenti (fino a un decennio) (32-34) fornirebbe un altro meccanismo per l’introduzione ripetuta di un ceppo di vaiolo all’interno di una comunità geografica o per contatto involontario con materiali di crosta o direttamente attraverso pratiche di variolazione.
Origine del VARV.
Possibili indizi sull’adattamento del VARV all’uomo possono essere trovati nella stretta relazione tra VARV e TATV/CMLV (4). Il TATV è associato a un roditore terrestre originario dell’Africa occidentale (35). Le nostre analisi di coalescenza indicano che la divergenza tra VARV e TATV si è verificata da 16.000 YBP (Tabella 2 e SI Dataset 4, sulla base delle registrazioni storiche del vaiolo del Sud Africa) a 68.000 YBP (Tabella 2 e SI Dataset 3, sulla base della prima storia di vaiolo registrata in Asia orientale). Così, come gli orthopoxvirus zoonotici correlati con serbatoi di roditori (6, 36, 37), VARV può essersi evoluto da un patogeno enzootico dei roditori africani e successivamente diffuso fuori dall’Africa.
Le sequenze genomiche degli isolati VARV selezionati per questo studio sono state prese dal deposito del Centro di Collaborazione dell’Organizzazione Mondiale della Sanità e, anche se mostrano un basso livello di divergenza di sequenza, sono rappresentative della maggiore diversità geografica e temporale all’interno della collezione. La filogenesi derivata da cSNP di questi isolati produce una topologia coerente con i modelli migratori umani storici, l’espansione della popolazione e le epidemie di vaiolo documentate. La topologia raffigurata supporta l’ipotesi (Fig. 3) che due cladi di variola divergano da un virus ancestrale e successivamente si evolvano in popolazioni umane geograficamente distinte. Anche se la ragione della diversa patogenesi umana di alastrim e VARV major non è chiara, la struttura genetica di alastrim minor e la sua topologia con gli altri isolati VARV aggiungono pezzi critici al puzzle evolutivo del vaiolo. Questa filogenesi proposta di VARV estende il tempo evolutivo del vaiolo rispetto a quello delle teorie precedenti.