RuBisCO

RuBisCO è uno dei tanti enzimi del ciclo di Calvin. Quando Rubisco facilita l’attacco di CO2 al carbonio C2 di RuBP e la successiva scissione del legame tra il carbonio C3 e C2, si formano 2 molecole di glicerato-3-fosfato. La conversione comporta questi passaggi: enolizzazione, carbossilazione, idratazione, scissione del legame C-C e protonazione.

SubstratiModifica

I substrati per RuBisCO sono ribulosio-1,5-bisfosfato e anidride carbonica (distinta dall’anidride carbonica “attivante”). RuBisCO catalizza anche una reazione di ribulosio-1,5-bisfosfato e ossigeno molecolare (O
2) invece di anidride carbonica (CO
2).Discriminare tra i substrati CO2 e O2 è attribuito alle diverse interazioni dei momenti di quadrupolo del substrato e un alto gradiente di campo elettrostatico. Questo gradiente è stabilito dalla forma dimerica del RuBisCO minimamente attivo, che con i suoi due componenti fornisce una combinazione di domini a carica opposta necessari per l’interazione dell’enzima con O2 e CO
2. Queste condizioni aiutano a spiegare il basso tasso di turnover riscontrato in RuBisCO: per aumentare la forza del campo elettrico necessario per una sufficiente interazione con i momenti di quadrupolo dei substrati, i segmenti terminali C e N dell’enzima devono essere chiusi, permettendo al sito attivo di essere isolato dal solvente e abbassando la costante dielettrica. Questo isolamento ha un costo entropico significativo, e risulta nello scarso tasso di turnover.

Binding RuBPEdit

La carbamilazione del gruppo ε-amino di Lys201 è stabilizzata dalla coordinazione con il Mg2+. Questa reazione comporta il legame dei termini carbossilati di Asp203 e Glu204 allo ione Mg2+. Il substrato RuBP si lega al Mg2+ spostando due dei tre ligandi aquo.

EnolizzazioneModifica

L’enolizzazione di RuBP è la conversione del tautomero cheto di RuBP in un enediolo (ate). L’enolizzazione è iniziata dalla deprotonazione a C3. La base dell’enzima in questo passo è stata discussa, ma i vincoli sterici osservati nelle strutture cristalline hanno reso Lys201 il candidato più probabile. In particolare, l’ossigeno carbammato su Lys201 che non è coordinato con lo ione Mg deprotonare il carbonio C3 di RuBP per formare un 2,3-enediolato.

CarbossilazioneModifica

Carbossilazione del 2,3-enediolato risulta nell’intermedio 3-cheto-2′-carbossilarabinitolo-1,5-bisfosfato e Lys334 è posizionato per facilitare l’aggiunta del substrato CO2 in quanto sostituisce la terza molecola di acqua coordinata al Mg2+ e aggiungere direttamente all’enediolo. Nessun complesso di Michaelis si forma in questo processo. L’idratazione di questo chetone provoca un ulteriore gruppo idrossilato su C3, formando un intermedio gem-diolo. La carbossilazione e l’idratazione sono state proposte come un singolo passo concertato o come due passi sequenziali. Il meccanismo concertato è supportato dalla vicinanza della molecola d’acqua a C3 di RuBP in più strutture cristalline. All’interno della struttura di spinaci, altri residui sono ben posizionati per aiutare nel passo di idratazione in quanto sono all’interno della distanza di legame idrogeno della molecola d’acqua.

C-C bond cleavageEdit

La gemma-diolo intermedio si fende al legame C2-C3 per formare una molecola di glicerato-3-fosfato e un carbossilato di carica negativa. La protonazione stereo specifica di C2 di questo carbanione dà come risultato un’altra molecola di glicerato-3-fosfato. Si pensa che questo passo sia facilitato da Lys175 o potenzialmente dal carbamilato Lys201.

ProdottiModifica

Quando l’anidride carbonica è il substrato, il prodotto della reazione della carbossilasi è un intermedio fosforilato instabile a sei carboni noto come 3-cheto-2-carbossiarabinitolo-1,5-bisfosfato, che decade rapidamente in due molecole di glicerato-3-fosfato. Il 3-fosfoglicerato può essere usato per produrre molecole più grandi come il glucosio.

Le attività collaterali di Rubisco possono portare a sottoprodotti inutili o inibitori; uno di questi prodotti è lo xilulosio-1,5-bisfosfato, che inibisce l’attività di Rubisco.

Quando l’ossigeno molecolare è il substrato, i prodotti della reazione dell’ossigenasi sono fosfoglicato e 3-fosfoglicerato. Il fosfoglicolato viene riciclato attraverso una sequenza di reazioni chiamata fotorespirazione, che coinvolge enzimi e citocromi situati nei mitocondri e nei perossisomi (questo è un caso di riparazione dei metaboliti). In questo processo, due molecole di fosfoglicolato sono convertite in una molecola di anidride carbonica e una molecola di 3-fosfoglicerato, che può rientrare nel ciclo di Calvin. Parte del fosfoglicolato che entra in questa via può essere trattenuto dalle piante per produrre altre molecole come la glicina. A livelli ambientali di anidride carbonica e ossigeno, il rapporto delle reazioni è di circa 4 a 1, il che risulta in una fissazione netta di anidride carbonica di solo 3,5. Così, l’incapacità dell’enzima di prevenire la reazione con l’ossigeno riduce notevolmente la capacità fotosintetica di molte piante. Alcune piante, molte alghe e batteri fotosintetici hanno superato questa limitazione escogitando mezzi per aumentare la concentrazione di anidride carbonica intorno all’enzima, compresa la fissazione del carbonio C4, il metabolismo degli acidi crassulacei e l’uso di pirenoide.

Tasso di attività enzimaticaModifica

Alcuni enzimi possono effettuare migliaia di reazioni chimiche ogni secondo. Tuttavia, RuBisCO è lento, fissando solo 3-10 molecole di anidride carbonica ogni secondo per molecola di enzima. La reazione catalizzata da RuBisCO è, quindi, il principale fattore limitante del ciclo di Calvin durante il giorno. Tuttavia, nella maggior parte delle condizioni, e quando la luce non limita la fotosintesi, la velocità di RuBisCO risponde positivamente all’aumento della concentrazione di anidride carbonica.

RuBisCO è solitamente attivo solo durante il giorno, poiché il ribulosio 1,5-bisfosfato non viene rigenerato al buio. Ciò è dovuto alla regolazione di diversi altri enzimi del ciclo di Calvin. Inoltre, l’attività di RuBisCO è coordinata con quella degli altri enzimi del ciclo di Calvin in diversi altri modi:

Dagli ioniModifica

Subita l’illuminazione dei cloroplasti, il pH dello stroma aumenta da 7,0 a 8,0 a causa del gradiente di protoni (ioni idrogeno, H+
) creato attraverso la membrana del tilakoide. Il movimento dei protoni nei tilakoidi è guidato dalla luce ed è fondamentale per la sintesi di ATP nei cloroplasti (Ulteriori letture: Centro di reazione fotosintetico; Reazioni dipendenti dalla luce). Per bilanciare il potenziale ionico attraverso la membrana, gli ioni di magnesio (Mg2+
) si muovono in risposta fuori dai tilakoidi, aumentando la concentrazione di magnesio nello stroma dei cloroplasti. RuBisCO ha un elevato pH ottimale (può essere >9,0, a seconda della concentrazione di ioni magnesio) e, quindi, viene “attivato” dall’introduzione di anidride carbonica e magnesio nei siti attivi come descritto sopra.

Per RuBisCO activaseEdit

Nelle piante e in alcune alghe, un altro enzima, RuBisCO activase (Rca, GO:0046863, P10896), è necessario per consentire la rapida formazione del carbammato critico nel sito attivo di RuBisCO. Questo è necessario perché il ribulosio 1,5-bisfosfato (RuBP) si lega più fortemente ai siti attivi di RuBisCO quando è presente un eccesso di carbammato, impedendo ai processi di andare avanti. Alla luce, l’attivasi di RuBisCO promuove il rilascio del RuBP inibitorio (o – in alcuni punti di vista – di stoccaggio) dai siti catalitici di RuBisCO. L’attivasi è anche richiesta in alcune piante (per esempio, il tabacco e molti fagioli) perché, al buio, RuBisCO è inibita (o protetta dall’idrolisi) da un inibitore competitivo sintetizzato da queste piante, un analogo del substrato 2-Carboxy-D-arabitinol 1-phosphate (CA1P). CA1P si lega strettamente al sito attivo del RuBisCO carbamilato e inibisce l’attività catalitica in misura ancora maggiore. CA1P ha anche dimostrato di mantenere RuBisCO in una conformazione protetta dalla proteolisi. Alla luce, l’attivasi di RuBisCO promuove anche il rilascio di CA1P dai siti catalitici. Dopo che il CA1P viene rilasciato da RuBisCO, viene rapidamente convertito in una forma non inibitoria da una CA1P-fosfatasi attivata dalla luce. Anche senza questi forti inibitori, una volta ogni diverse centinaia di reazioni, le normali reazioni con anidride carbonica o ossigeno non vengono completate; altri analoghi inibitori del substrato si formano ancora nel sito attivo. Ancora una volta, l’attivasi RuBisCO può promuovere il rilascio di questi analoghi dai siti catalitici e mantenere l’enzima in una forma cataliticamente attiva. Tuttavia, ad alte temperature, l’attivasi RuBisCO si aggrega e non può più attivare RuBisCO. Questo contribuisce alla diminuita capacità carbossilante osservata durante lo stress termico.

Per ATP/ADP e stato di riduzione/ossidazione stromale attraverso l’attivasiModifica

La rimozione dell’inibitore RuBP, CA1P, e degli altri analoghi inibitori del substrato da parte dell’attivasi richiede il consumo di ATP. Questa reazione è inibita dalla presenza di ADP e, quindi, l’attività dell’attivasi dipende dal rapporto di questi composti nello stroma del cloroplasto. Inoltre, nella maggior parte delle piante, la sensibilità dell’attivasi al rapporto ATP/ADP è modificata dallo stato di riduzione/ossidazione (redox) stromale attraverso un’altra piccola proteina regolatrice, la tioredossina. In questo modo, l’attività dell’attivasi e lo stato di attivazione di RuBisCO possono essere modulati in risposta all’intensità della luce e, quindi, al tasso di formazione del substrato ribulosio 1,5-bisfosfato.

Per fosfatoModifica

Nei cianobatteri, anche il fosfato inorganico (Pi) partecipa alla regolazione coordinata della fotosintesi: Il Pi si lega al sito attivo di RuBisCO e a un altro sito sulla grande catena dove può influenzare le transizioni tra conformazioni attivate e meno attive dell’enzima. In questo modo, l’attivazione della RuBisCO batterica potrebbe essere particolarmente sensibile ai livelli di Pi, il che potrebbe indurla ad agire in modo simile a come l’attivasi RuBisCO funziona nelle piante superiori.

Con l’anidride carbonicaModifica

Siccome l’anidride carbonica e l’ossigeno competono al sito attivo della RuBisCO, la fissazione del carbonio da parte della RuBisCO può essere migliorata aumentando il livello di anidride carbonica nel compartimento contenente la RuBisCO (stroma del cloroplasto). Più volte durante l’evoluzione delle piante, si sono evoluti meccanismi per aumentare il livello di anidride carbonica nello stroma (vedi fissazione del carbonio C4). L’uso dell’ossigeno come substrato sembra essere un processo sconcertante, poiché sembra buttare via l’energia catturata. Tuttavia, potrebbe essere un meccanismo per prevenire il sovraccarico di carboidrati durante i periodi di alto flusso luminoso. Questa debolezza dell’enzima è la causa della fotorespirazione, per cui le foglie sane in piena luce possono avere una fissazione netta del carbonio pari a zero quando il rapporto tra O
2 e CO
2 disponibile per RuBisCO si sposta troppo verso l’ossigeno. Questo fenomeno è principalmente dipendente dalla temperatura: Le alte temperature possono diminuire la concentrazione di CO
2 disciolta nell’umidità dei tessuti fogliari. Questo fenomeno è anche legato allo stress idrico: Poiché le foglie delle piante sono raffreddate per evaporazione, l’acqua limitata causa alte temperature delle foglie. Le piante C4 usano inizialmente l’enzima PEP carbossilasi, che ha una maggiore affinità per la CO
2. Il processo produce prima un composto intermedio a 4 carboni, che viene trasportato in un sito di fotosintesi C3 e poi de-carbossilato, rilasciando CO
2 per aumentare la concentrazione di CO
2, da cui il nome piante C4.

Le piante a metabolismo acido crassulaceo (CAM) tengono i loro stomi chiusi durante il giorno, il che conserva l’acqua ma impedisce che le reazioni indipendenti dalla luce (il ciclo di Calvin) abbiano luogo, poiché queste reazioni richiedono che la CO
2 passi attraverso queste aperture. L’evaporazione attraverso il lato superiore di una foglia è impedita da uno strato di cera.