Dose ed effetti temporali dell’assunzione di caffeina sui recettori dell’adenosina A2A delle piastrine umane

La caffeina, presente in diverse fonti come caffè, tè, cioccolato e bevande alla cola, è la sostanza più ampiamente attiva nel mondo. Il consumo medio di caffeina da parte degli esseri umani adulti varia tra le diverse culture e nazioni da 80 a 400 mg per persona al giorno.1 La caffeina provoca un numero diverso di risposte farmacologiche, tra cui l’aumento della vigilanza, la diminuzione del tempo di reazione psicomotoria, l’aumento della latenza del sonno e del tempo di veglia e può anche influenzare le prestazioni intellettuali.2 Inoltre, la caffeina provoca il rilassamento della muscolatura liscia, aumenta la secrezione di acido gastrico e il rilascio di catecolamine, e aumenta l’attività metabolica.3

I meccanismi precisi alla base delle azioni della caffeina rimangono poco definiti. Anche se l’inibizione delle fosfodiesterasi può contribuire alle azioni della caffeina,4 vi è una crescente evidenza che la maggior parte degli effetti farmacologici di questa xantina derivano dall’antagonismo dei recettori dell’adenosina designati come A1, A2A, A2B, e A3 sottotipi.5 Caffeina agisce più potentemente ai recettori A2A, seguita da vicino dai recettori A1, poi A2B recettori,6 e come un debole antagonista ai recettori A3 umano. Blocco da caffeina dei recettori dell’adenosina, vale a dire i tipi di recettori A1 e A2A, inibisce l’azione di adenosina endogena su una varietà di processi fisiologici.7 In condizioni normali, i livelli ematici di adenosina sembrano essere sufficienti per attivare tonicamente recettori A2A nelle piastrine. Recentemente, nei topi privi del recettore A2A, è stato riportato che l’aggregazione piastrinica è aumentata, indicando l’importanza di questo sottotipo di recettore nella funzione piastrinica.8 È quindi ipotizzabile che la caffeina possa bloccare questi recettori A2A attivati tonicamente nelle piastrine e alterare le loro funzioni modulate dall’adenosina.

Per molti anni si è sospettata un’associazione tra il consumo di caffè e le malattie cardiovascolari, in particolare le malattie coronariche,9 ma recentemente è stato dimostrato che il consumo di caffè o caffeina non aumenta il rischio di malattie coronariche o ictus.1011 Numerosi studi epidemiologici riguardanti l’infarto del miocardio non hanno trovato alcun effetto deleterio con <5 tazze di caffè al giorno, mentre i risultati sono controversi a livelli di assunzione più alti.12 Nei pazienti con ipertensione, non è stato osservato alcun rischio di esito negativo a qualsiasi livello di assunzione di caffeina.13

Uno studio di Biaggioni et al14 ha scoperto che un regime di dosaggio ripetuto di caffeina porta a cambiamenti significativi nelle piastrine umane nelle risposte funzionali all’agonista del recettore dell’adenosina 5′-N-etilcarboxamidoadenosina (NECA). Il ritiro della caffeina ha prodotto un significativo spostamento verso sinistra dell’inibizione dell’aggregazione indotta dal NECA.14 Coerentemente con questo, abbiamo recentemente dimostrato,15 in soggetti trattati con 750 mg/d per 1 settimana, che l’assunzione cronica di caffeina altera l’aggregabilità piastrinica come risultato dell’upregolazione dei recettori A2A situati sulla superficie piastrinica.

Nel presente articolo, forniamo ulteriori prove che una risposta simile si trova in soggetti trattati con caffeina a dosi diverse, come 600 mg/d per 1 settimana o 400 mg/d, somministrata per un periodo di tempo più lungo, come 2 settimane. Nel presente studio, ciò è stato fatto misurando direttamente i cambiamenti dei recettori dell’adenosina A2A (densità e affinità) e la loro funzione determinando l’effetto dell’agonista selettivo A2A 2-hexynyl-NECA (HE-NECA) per (1) aumentare l’accumulo di cAMP, (2) inibire l’aggregazione piastrinica e (3) diminuire i livelli di calcio intracellulare. Dopo un consumo cronico (600 mg/d per 1 settimana o 400 mg/d per 2 settimane), è stata riscontrata un’upregolazione dei recettori adenosinici A2A piastrinici, che era altamente correlata con effetti antiaggreganti, un aumento dell’accumulo di cAMP e una diminuzione dei livelli di calcio intracellulare. Nessuna differenza è stata rivelata sui parametri di legame e funzionali dai soggetti trattati con 400 mg/d per 1 settimana.

Metodi

Sono stati studiati quarantacinque soggetti sani, non fumatori, di età compresa tra 25 e 45 anni, di entrambi i sessi. Dopo aver dato il consenso informato scritto, ai soggetti è stato chiesto di astenersi dalle metilxantine alimentari per ≥2 settimane. Sono stati divisi in 3 gruppi (15 soggetti ciascuno) secondo il regime di somministrazione della caffeina (cioè, dose e durata della somministrazione): 200 mg per via orale 2 volte al giorno per un periodo di 7 giorni (gruppo 1); 200 mg per via orale 2 volte al giorno per un periodo di 14 giorni (gruppo 2); e 200 mg per via orale 3 volte al giorno per un periodo di 7 giorni (gruppo 3). Le piastrine di questi soggetti sono state studiate prima di iniziare la caffeina (giorno 0) e a 1, 12, 60 e 108 ore dopo l’ultima dose di caffeina. In particolare, il punto temporale di 1 ora è stato studiato solo nel gruppo che ha ricevuto la dose massima di caffeina (600 mg/d). Non è stato possibile ottenere EC50 e IC50 nei saggi funzionali a 1 ora a causa dei problemi pratici legati all’eccessivo prelievo di sangue in un periodo di tempo ristretto (da 1 a 12 ore).

SCH 58261 Binding Assay in Human Platelet Membranes

Le membrane delle piastrine umane sono state preparate come precedentemente descritto16 e utilizzate per i saggi di legame dei radioligandi con SCH 58261 secondo Varani et al.17 Negli studi di saturazione, le membrane delle piastrine umane sono state incubate con 8-10 diverse concentrazioni di SCH 58261 che vanno da 0,01 a 10 nmol/L. Il legame aspecifico è stato determinato in presenza di NECA 10 μmol/L. Dopo 60 minuti di incubazione a 4°C, i campioni sono stati filtrati attraverso filtri Whatman GF/B con un Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co). Un ponderato non lineare minimi quadrati curva-fitting programma, LIGAND,18 è stato utilizzato per l’analisi del computer dei dati dagli esperimenti di saturazione.

Misurazione dei livelli di cAMP in piastrine umane

Piastrine umane lavati ottenuti dal sangue periferico di volontari sani sono stati preparati come descritto in precedenza.16 Le piastrine (da 6×104 a 8×104 cellule) sono state incubate con 1,0 U di adenosina deaminasi/mL, 0,5 mmol/L 4-(3-butoxy-4-methoxybenzyl)-2-imidazolidinone (Ro 20-1724) come inibitore della fosfodiesterasi, e 6-8 diverse concentrazioni di HE-NECA. I valori EC50 sono stati ottenuti dalle curve concentrazione-risposta dopo la trasformazione log-logit delle variabili dipendenti con un metodo dei minimi quadrati ponderato.19 La soluzione acquosa finale è stata testata per i livelli di cAMP con un saggio di competizione per il legame delle proteine.15

Saggio di aggregazione piastrinica

Il sangue umano citrato è stato centrifugato a 200g per 10 minuti per ottenere plasma ricco di piastrine e a 2500g per 20 minuti per ottenere plasma povero di piastrine. La conta delle piastrine umane è stata eseguita in un Coulter Counter modello S8/80 (Coulter Electronics Inc) e regolata a 2.5×108/mL a 3.5×108/mL con plasma autologo povero di piastrine. L’aggregazione piastrinica è stata eseguita secondo la tecnica turbidimetrica di Born20 con un DIC PA-3220 Aggrecorder (Kyoto Daiichi Kagatu Co). Dopo l’incubazione per 3 minuti con 6-8 diverse concentrazioni di HE-NECA, il plasma ricco di piastrine è stato aggregato a 37°C sotto agitazione continua con ADP. Esperimenti simili sono stati eseguiti con ADP a diverse concentrazioni (da 100 nmol/L a 100 μmol/L). L’aggregazione massima, registrata 5 minuti dopo l’aggiunta di ADP, è stata usata per l’analisi quantitativa, e la percentuale di inibizione è stata calcolata in relazione ai valori di controllo.21

Misurazioni della concentrazione di Ca2+ libero citoplasmatico

La concentrazione di calcio libero citosolico è stata misurata usando la tecnica fura 2 secondo Paul et al.22 In breve, le piastrine sono state incubate nel buio totale per 30 minuti a 37°C con 1 μmol/L fura 2-AM e agitate magneticamente in cuvette per fluorimetro (LS50, Perkin Elmer, Ltd) ad una concentrazione di 108/mL in presenza di 250 μmol/L sulfinpyrazone. La concentrazione intracellulare di Ca2+ (i) è stata determinata con un rapporto di eccitazione di 340/380 e una lunghezza d’onda di emissione di 505 nm.

Analisi statistica

L’analisi dei dati è stata effettuata da 1way ANOVA. L’analisi delle differenze tra i gruppi trattati con caffeina (12, 60 e 108 ore) e i soggetti di controllo è stata fatta con il test t di Student (analisi non appaiata). Le differenze sono state considerate significative ad un valore di P<0,01. Tutti i dati sono riportati come media±SEM.

Risultati

Le piastrine dei 3 gruppi di soggetti sono state raccolte prima dell’inizio della somministrazione della caffeina (giorno 0, controllo) e a 1, 12, 60 e 108 ore dopo l’ultima dose (sospensione della caffeina). La tabella riassume i risultati degli esperimenti di legame e funzionali dai 3 gruppi di soggetti.

Gruppo 1 (400 mg/d per 1 settimana)

I parametri di legame hanno rivelato un valore Bmax di controllo di 105±6 fmol/mg di proteine e un valore KD di 1,28±0,08 nmol/L. Nelle piastrine di controllo, HE-NECA ha aumentato i livelli di cAMP con un EC50 di 60±5 nmol/L e ha inibito (1) l’aggregazione con un IC50 di 86±10 nmol/L e (2) i livelli di calcio con un IC50 di 104±8 nmol/L. Non sono state trovate differenze statisticamente significative nei parametri di legame e funzionali a 12, 60 e 108 ore dopo il ritiro della caffeina (tabella).

Gruppo 2 (400 mg/d per 2 settimane)

I parametri di legame hanno rivelato un valore Bmax di controllo di 110±3 fmol/mg di proteine e un valore KD di 1,21±0,09 nmol/L. A 12 e 60 ore dopo il ritiro della caffeina, le densità del recettore, Bmax, sono aumentate in entrambi i punti temporali di circa il 20%, ma i valori KD sono rimasti invariati. Gli esperimenti funzionali hanno rivelato che l’agonista del recettore dell’adenosina A2A HE-NECA era significativamente più potente nell’aumentare il cAMP piastrinico (cioè, i valori EC50 erano 45% e 65% più piccoli a 12 e 60 ore dopo il ritiro della caffeina rispetto ai valori di controllo, rispettivamente). Una tendenza simile è stata osservata nei valori IC50 ottenuti negli esperimenti di aggregazione e nelle misurazioni della concentrazione citoplasmatica di calcio libero (tabella).

Gruppo 3 (600 mg/d per 1 settimana)

In generale, abbiamo ottenuto dati simili a quelli del gruppo 2. Il SCH 58261 si è legato a una singola classe di affinità di siti nelle membrane piastriniche dei controlli con una Bmax di 100±4 fmol/mg di proteine e una KD di 1,27±0,09 nmol/L. Come mostrato nella Figura 1A, nelle membrane delle piastrine raccolte a 1, 12, 60 e 108 ore dopo il ritiro della caffeina, il radioligando si è legato con la stessa affinità, ma il numero di siti di legame (Bmax) è aumentato significativamente (P<0.01). In studi paralleli, sono state determinate le risposte funzionali delle piastrine all’agonista del recettore A2A HE-NECA. Come riassunto nella tabella, la potenza di HE-NECA per (1) aumentare la formazione di cAMP, (2) inibire l’aggregazione piastrinica indotta da ADP e (3) diminuire i livelli di calcio è stata significativamente aumentata nelle piastrine ottenute a 12, 60 e 108 ore dopo la sospensione della caffeina (Figura 1B, 1C e 1D). Gli esperimenti sono stati effettuati anche per determinare se l’aumento della densità dei recettori A2A sarebbe stato accompagnato da una diminuzione della potenza e/o efficienza di ADP per indurre l’aggregazione. I valori EC50 di ADP per stimolare l’aggregazione piastrinica a 12, 60 e 108 ore dopo il ritiro della caffeina erano 0,7±0,2, 0,9±0,1 e 0,8±0,1 μmol/L, rispettivamente, valori non significativamente diversi dai 0,9±0.2 μmol/L ottenuti nelle piastrine dei controlli (Figura 2).

Discussione

Gli effetti della somministrazione a lungo termine di caffeina negli esseri umani e negli animali e il suo ruolo nella loro tolleranza alle azioni della caffeina sono controversi. Alcuni studi che mostrano un aumento dei recettori A1 nel cervello del topo hanno trovato prove di un’upregolazione dose-dipendente dei recettori A1 da parte della caffeina.23 Altri studi hanno rivelato un’upregolazione dei recettori A2A, suggerendo un effetto adattivo dell’assunzione di caffeina.24 Inoltre, il consumo cronico di caffeina può portare a una riduzione dell’aggregabilità piastrinica come risultato dell’upregolazione dei recettori A2A situati sulla superficie piastrinica14 che svolgono un ruolo potenziale nei processi fisiopatologici, come l’aggregazione e la trombogenesi. Sebbene tali cambiamenti possano contribuire alle alterazioni della funzione piastrinica, la tolleranza alla caffeina non modifica la potenza di questa xantina come antagonista competitivo degli effetti dell’adenosina.25 Altri cambiamenti, come lo spostamento dell’affinità del recettore a uno stato di alta affinità, alterazioni nei livelli di proteine G o l’accoppiamento di queste proteine ai recettori dell’adenosina, o l’occupazione del recettore a lungo termine possono essere coinvolti nel fenomeno della tolleranza.26 I sintomi da astinenza alla caffeina si verificano negli esseri umani; tipicamente, sono mal di testa, affaticamento, apatia e sonnolenza.9 In particolare, la caffeina aumenta la concentrazione plasmatica di adenosina, e la sua riduzione dopo la sospensione dell’antagonista suggerisce una regolazione mediata dai recettori della concentrazione plasmatica di adenosina.27 Durante l’ischemia e/o l’ipossia, l’adenosina ha anche azioni neuroprotettive. Nel cervello adulto, il trattamento cronico con caffeina, che porta all’upregolazione dei recettori dell’adenosina, riduce il danno ischemico, mentre l’esposizione acuta (effetto antagonista del recettore) aumenta il danno ischemico.28

È stato dimostrato che l’assunzione cronica di caffeina altera la risposta delle piastrine alle azioni dell’adenosina.14 La somministrazione ripetuta di caffeina (750 mg/d per 1 settimana) ha rivelato un aumento della densità del recettore A2A, accompagnato da una sensibilizzazione delle risposte piastriniche, come un aumento dell’accumulo di cAMP e una diminuzione dell’aggregazione piastrinica.15 Lo scopo del presente studio era di determinare l’effetto del dosaggio di caffeina e della durata della somministrazione sui parametri di legame e funzionali. Quindi, abbiamo studiato i cambiamenti nella densità e nell’affinità dei recettori A2A dell’adenosina nelle membrane piastriniche umane di soggetti trattati con diverse dosi (400 o 600 mg/d) per diversi periodi di assunzione di caffeina (1 o 2 settimane). In particolare, abbiamo studiato soggetti di controllo (prima della somministrazione di caffeina) e soggetti trattati con caffeina (1, 12, 60 e 108 ore dopo l’ultima dose di caffeina).

Il trattamento con 400 mg/d di caffeina per 1 settimana non ha modificato i parametri funzionali e di legame del recettore A2A. Tuttavia, il trattamento con 400 mg/d per 2 settimane o 600 mg/d per 1 settimana ha provocato (1) un aumento significativo (upregulation) dei siti di legame dell’adenosina A2A, (2) un aumento dell’accumulo di cAMP, (3) un aumento degli effetti antiaggreganti e (4) una diminuzione dei livelli di calcio suscitati dall’agonista del recettore A2A HE-NECA.

L’upregulation dei recettori A2A può probabilmente essere attribuita alla sintesi di nuovi recettori durante il differenziamento delle cellule precursori. Questa interpretazione si basa sui risultati di esperimenti in vitro che mostrano che l’incubazione di plasma ricco di piastrine da soggetti di controllo per un periodo di 6 o 12 ore con caffeina o SCH 58261 non ha influenzato i parametri di legame.15 L’upregulation dei recettori A2A dell’adenosina causata dall’assunzione cronica di caffeina potrebbe essere interpretata per indicare che l’adenosina endogena ha un’influenza tonica sulle piastrine umane, e la presenza dell’antagonista è controbilanciata dall’upregulation dei recettori A2A. Negli adulti, la caffeina viene assorbita in modo efficiente dal tratto gastrointestinale; le concentrazioni plasmatiche di picco si verificano da 15 a 120 minuti dopo l’ingestione e l’emivita della caffeina è da 2,5 a 4,5 ore.7 L’aumento dei recettori A2A dell’adenosina trovato a 1 ora dopo l’ultima dose di trattamento con caffeina era simile a quello ottenuto a 12 o 60 ore dopo il ritiro della caffeina, dimostrando che il ritiro non era necessario per l’upregulation dei recettori A2A.

Un altro scopo del presente studio era quello di determinare se i cambiamenti nei parametri di legame correlato a cambiamenti nella risposta funzionale (s). Si è scoperto che l’aggregazione piastrinica era associata all’attivazione dell’adenilato ciclasi e a un aumento delle concentrazioni di calcio intracellulare. La potenza di HE-NECA a 12, 60 e 108 ore dopo il ritiro della caffeina era significativamente aumentata rispetto al gruppo di controllo. Questo risultato indica che la somministrazione ripetuta di diverse dosi di caffeina porta a cambiamenti significativi nel numero di recettori A2A sulla superficie delle piastrine, accompagnati da una maggiore reattività alla stimolazione del recettore. Il classico recettore A2A dell’adenosina è responsabile delle proprietà antiaggreganti dell’adenosina e dei suoi analoghi, il che è coerente con l’osservazione che l’aggregazione è più efficiente nei topi privi dei recettori A2A.8 Tuttavia, l’aggregazione piastrinica indotta da concentrazioni crescenti di ADP non era significativamente diversa tra il controllo e i soggetti trattati con caffeina. Una possibile spiegazione per quest’ultima osservazione è che non c’è abbastanza adenosina nel mezzo di prova per produrre una risposta. In alternativa, nei soggetti trattati con caffeina, la grandezza di upregulation del recettore (cioè, il numero di recettori) non era sufficiente a produrre uno spostamento della concentrazione ADP-indotta curva di risposta. Tuttavia, quando i livelli di adenosina endogena aumentano, come durante l’ischemia miocardica, la concentrazione extracellulare di adenosina sale rapidamente a un livello sufficiente per agire sui recettori upregolati e può avere maggiori effetti inibitori piastrinici rispetto al controllo. Quindi, è possibile che il consumo cronico di caffeina in dosi non lontane dall’apporto dietetico medio possa portare a una riduzione paradossale dell’aggregabilità piastrinica durante l’ischemia.

In conclusione, tutti i dati insieme forniscono ulteriori prove che l’assunzione cronica di caffeina altera la risposta delle piastrine alle azioni dell’adenosina. La scoperta principale del presente studio è che gli effetti del consumo cronico di caffeina sulle funzioni piastriniche sono dipendenti sia dalla dose che dalla durata del trattamento e sono alla base di una riduzione dell’aggregabilità piastrinica dovuta all’upregolazione dei recettori A2A dell’adenosina.

Note