La cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) è una forma di cromatografia su colonna che pompa una miscela di campione o analita in un solvente (noto come fase mobile) ad alta pressione attraverso una colonna con materiale di imballaggio cromatografico (fase stazionaria). Il campione è trasportato da un flusso di gas vettore in movimento di elio o azoto. L’HPLC ha la capacità di separare e identificare i composti che sono presenti in qualsiasi campione che può essere disciolto in un liquido in concentrazioni di tracce basse come parti per trilione. A causa di questa versatilità, l’HPLC è usato in una varietà di applicazioni industriali e scientifiche, come quelle farmaceutiche, ambientali, forensi e chimiche.
Il tempo di ritenzione del campione varia a seconda dell’interazione tra la fase stazionaria, le molecole da analizzare e il solvente o i solventi utilizzati. Mentre il campione passa attraverso la colonna, interagisce tra le due fasi a velocità diverse, principalmente a causa delle diverse polarità degli analiti. Gli analiti che hanno la minore quantità di interazione con la fase stazionaria o la maggiore quantità di interazione con la fase mobile usciranno dalla colonna più velocemente.
Strumentazione:
I componenti principali di un sistema HPLC includono il serbatoio del solvente, o più serbatoi, una pompa ad alta pressione, una colonna, un sistema di iniezione e il rivelatore.
Limite di rilevazione |
Raccomandazione gas |
Raccomandazione regolatore |
| Gas di spurgo | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 series |
Il serbatoio contiene il solvente, che viene chiamato fase mobile perché si muove. Di solito ci sono almeno due serbatoi in un sistema, ognuno dei quali contiene fino a 1000 cc di solvente e di solito è dotato di un diffusore di gas attraverso il quale è possibile far gorgogliare l’elio. Una pompa viene utilizzata per generare un flusso specifico della fase mobile. Anche se l’iniezione manuale dei campioni è ancora possibile, la maggior parte degli HPLC sono ora completamente automatizzati e controllati dal computer. L’iniettore, o campionatore automatico, introduce il solvente in un flusso di fase che porta il campione nella colonna ad alta pressione (fino a 400 bar), che contiene materiale di imballaggio specifico necessario per effettuare la separazione. Il materiale d’imballaggio è chiamato fase stazionaria perché è tenuto in posizione dall’hardware della colonna.
Un rivelatore è necessario per vedere le bande di composti separati mentre eluiscono dalla colonna ad alta pressione. Le informazioni vengono inviate dal rivelatore a un computer che genera il cromatogramma. La fase mobile esce dal rivelatore e viene inviata a un rifiuto o raccolta, come desiderato.
Lo sparging di elio è un metodo efficace di degassificazione della fase mobile per evitare linee di base instabili causate dall’aria dissolta. L’azoto è usato come gas di nebulizzazione nel rivelatore a diffusione di luce evaporativa (ELSD) dove il solvente viene evaporato dal campione lasciando una nebbia come viene misurato.
Cromatografia liquida ad alte prestazioni – Altri tipi di HPLC
Cromatografia liquida ad alte prestazioni (uHPLC):
Se l’HPLC standard usa tipicamente particelle di colonne con dimensioni da 3 a 5 µm e pressioni di circa 400 bar, l’uHPLC usa colonne appositamente progettate con particelle fino a 1,7 µm, a pressioni superiori a 1000 bar. Il vantaggio principale di una uHPLC è la velocità. Questi sistemi sono più veloci, più sensibili e si basano su volumi minori di solventi organici rispetto all’HPLC standard, con la conseguente possibilità di eseguire più campioni in meno tempo. Tuttavia, se i sistemi vengono eseguiti a pressioni tipiche superiori a 800 bar, le colonne invecchiano o si degradano più rapidamente. Si sta sviluppando una tecnologia più recente per le unità uHPLC per utilizzare particelle di colonna con dimensioni di 1µm e potenziali di pressione fino a 6.800 bar.
uHPLC è anche conosciuto come UPLCTM, un marchio di fabbrica della Waters Corporation.
Cromatografia liquida rapida delle proteine (FPLC):
FPLC è un sistema simile alla cromatografia liquida ad alte prestazioni che viene utilizzato per separare o purificare proteine e altre biomolecole da miscele complesse. La differenza principale tra FPLC e HPLC è la pressione di lavoro standard. Le colonne FPLC possono essere utilizzate solo fino a pressioni massime di 3-5 MPa. Se la pressione dell’HPLC può essere limitata, quasi ogni colonna FPLC può essere utilizzata anche in un sistema HPLC.