2 Physiological Evidence of Endozepines
La sintesi di RO 15-1788 (o flumazenil, FLZ), il primo antagonista BZ conosciuto (Hunkeler et al, 1981; Ramerstorfer, Furtmüller, Vogel, Huck, & Sieghart, 2010), ha facilitato un ampio corpo di ricerca a sostegno dell’ipotesi che i ligandi endogeni al sito di legame BZ esistono e sono funzionalmente rilevanti in vitro e in vivo. Mentre FLZ è stato uno strumento prezioso per l’identificazione di azioni fisiologiche BZ, il suo uso per questo scopo ha dei limiti. Ad esempio, è stato dimostrato che FLZ può esercitare effetti PAM in GABAARs eterologicamente espresso, soprattutto ad alte concentrazioni (Ramerstorfer et al., 2010). È importante notare che FLZ non ha mai dimostrato di avere effetti NAM sui GABAAR eterologicamente espressi, suggerendo che eventuali effetti NAM di FLZ sull’inibizione GABA-mediata sono molto probabilmente dovuti all’antagonismo di un ligando endogeno.
Studi in vitro hanno suggerito una serie di circuiti in cui le endozepine sono costitutivamente espresse e fisiologicamente attive, come evidenziato dagli effetti soppressivi di FLZ sull’inibizione GABA-mediata, principalmente attraverso una diminuzione della durata della risposta. Per esempio, FLZ sopprime IPSP (C) in ippocampo (King, Knox, Dingledine, 1985; Krespan, Springfield, Haas, & Geller, 1984) e in culture neuronali neocorticali (Vicini et al., 1986). FLZ ha dimostrato di sopprimere l’inibizione in cellule di granuli del giro dentato nel modello pilocarpina di epilessia del lobo temporale (Leroy, Poisbeau, Keller, & Nehlig, 2004) e per sopprimere l’inibizione in strato II/III neuroni piramidali neocorticali (Ali & Thomson, 2008). Potenziamento a lungo termine delle sinapsi inibitorie nell’area ippocampale CA1 è stato associato ad un aumento dell’ampiezza IPSC che è stato soppresso da FLZ (Xu & Sastry, 2005). Più recentemente, è stato dimostrato che FLZ sopprime i neuroni di inibizione sinaptica del nucleo reticolare talamico (nRt, Christian et al., 2013), indicando la presenza di una endozepina in questo nucleo. Insieme, questi studi con FLZ sostengono fortemente la presenza di attività PAM endogena in diverse regioni cerebrali distinte, indicando che questo è un meccanismo modulatorio endogeno ampiamente implementato nel SNC.
Una serie di interessanti risultati clinici sono coerenti con l’antagonismo FLZ della funzione endozepina. Per esempio, il trattamento FLZ può indurre attacchi di panico in pazienti con disturbo di panico, ma non in controlli sani (Nutt, Glue, Lawson, & Wilson, 1990). Può anche precipitare una maggiore risposta di panico nelle donne con disturbo disforico premestruale rispetto ai controlli (Le Mellédo, Van Driel, Coupland, Lott, & Jhangri, 2000) e per invertire lo stupore associato a encefalopatia epatica (Als-Nielsen, Gluud, & Gluud, 2004; Baraldi et al., 2009). Insieme questi studi suggeriscono un ruolo fisiologico per un accumulo di endozepine nello spazio extracellulare, cioè un accumulo fisiologico, nella regolazione dell’ansia/panico. Inoltre, i livelli sierici di sostanze che inibiscono il legame di FLZ alle membrane cerebellari di ratto sono stati segnalati per aumentare di due volte durante il parto con travaglio spontaneo, un effetto non visto in pazienti sottoposti a taglio cesareo (Facchinetti, Avallone, Modugno, & Baraldi, 2006), suggerendo che gli stati fisiologici come il lavoro potrebbe causare accumulo di endozepine.
La rilevanza di questi risultati per i pazienti umani con epilessia rimane per il momento sconosciuta, in quanto le prove per le azioni di endozepina in pazienti con epilessia è inconcludente. FLZ può provocare convulsioni nei pazienti, ma almeno alcuni pazienti erano probabilmente in trattamento con BZ (Spivey, 1992). Per esempio, in una serie di 67 pazienti sottoposti a valutazione prima della chirurgia dell’epilessia (Schulze-Bonhage & Elger, 2000), le crisi sono state provocate in 8 (12%) – tutti erano stati precedentemente trattati con BZ. Case report suggeriscono peggioramento delle crisi da FLZ nei bambini e negli anziani (McDuffee & Tobias, 1995; Thomas, Lebrun, & Chatel, 1993). Gli effetti riportati di FLZ sulle convulsioni negli studi sugli animali sono anche misti. Nei ratti più giovani di 2 settimane, FLZ peggiora crisi motorie minori indotte da PTZ (Rathouská, Kubová, Mares, & Vorlícek, 1993). In particolare in modelli convulsivi ad alte dosi, sia la soppressione dell’attività convulsiva (Kaijima, Le Gal La Salle, & Rossier, 1983) o nessun effetto (Hunkeler et al., 1981) è stato riportato. Nel modello GAERS di epilessia genetica spontanea assenza, FLZ aveva effetti concentrazione-dipendenti, con basse dosi sopprimendo scariche spike-wave (SWDs) e dosi più elevate aumentando loro (Marescaux et al., 1984). Inoltre, una mutazione genetica (R43Q) nella subunità γ2 umana associata sia all’assenza familiare che alle crisi febbrili ha dimostrato di abolire (Wallace et al., 2001) o di ridurre (Bowser et al., 2002) la sensibilità in vitro di GABAAR specifici al DZP. Il meccanismo dell’aumento dell’attività convulsiva legato all’insensibilità del recettore al DZP, un ligando esogeno, non è ancora noto. Un’ipotesi provocatoria è che la mutazione rende i recettori insensibili a un BZ endogeno naturale. Poiché un BZ endogeno avrebbe probabilmente proprietà antiepilettiche, le mutazioni nel recettore che impediscono il legame del BZ endogeno dovrebbero causare crisi. Tuttavia, il traffico del recettore è anche influenzato da questa mutazione (Kang & Macdonald, 2004; Sancar & Czajkowski, 2004) e potrebbe contribuire all’attività convulsiva, quindi il ruolo delle endozepine nelle crisi legate alla mutazione γ2R43Q rimane controverso.
FLZ è stato anche riportato per invertire lo stupor idiopatico ricorrente (Rothstein et al., 1992), anche se negli ultimi anni, è diventato evidente che almeno alcuni pazienti che hanno risposto a FLZ aveva surrettiziamente BZ uso (Granot, Berkovic, Patterson, Hopwood, & Mackenzie, 2004) e questo campo rimane controverso (Cortelli et al., 2005). In uno studio recente, FLZ normalizzato vigilanza in un gruppo ben caratterizzato di pazienti con ipersonnia. Un’attività peptidergica PAM è stata trovata nel liquido cerebrospinale (CSF) di questi pazienti (Rye et al., 2012). Tuttavia, il PAM non ha interagito con un potenziamento dal midazolam BZ e parzialmente persistito in α1(H101R), GABAARs con una mutazione puntiforme che li rende insensibili BZ, indicando che potrebbe non essere un classico agente BZ-mimetico (Rye et al., 2012). L’identità di questo PAM CSF e il suo ruolo nella fisiopatologia dell’ipersonnia rimangono sconosciuti.