A nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (HPLC) az oszlopkromatográfia egyik formája, amely a mintakeveréket vagy analitot egy oldószerben (az úgynevezett mobil fázisban) nagy nyomáson egy kromatográfiás töltőanyaggal (állófázis) ellátott oszlopon keresztül pumpálja. A mintát egy héliumból vagy nitrogénből álló mozgó vivőgázáram szállítja. A HPLC képes olyan vegyületek elválasztására és azonosítására, amelyek bármilyen folyadékban oldott mintában jelen vannak, akár nyomokban, akár trilliomodrésznyi koncentrációban is. E sokoldalúságának köszönhetően a HPLC-t számos ipari és tudományos alkalmazásban használják, például a gyógyszeriparban, a környezetvédelemben, a kriminalisztikában és a vegyiparban.
A minta retenciós ideje az állófázis, az elemzett molekulák és az alkalmazott oldószer vagy oldószerek közötti kölcsönhatástól függően változik. Ahogy a minta áthalad az oszlopon, különböző sebességgel lép kölcsönhatásba a két fázis között, elsősorban az analitok eltérő polaritása miatt. Azok az analitok, amelyek a legkisebb mértékben lépnek kölcsönhatásba az állófázissal vagy a legnagyobb mértékben a mozgófázissal, gyorsabban távoznak az oszlopból.
Készülék:
A HPLC-rendszer fő összetevői közé tartozik az oldószertartály vagy több tartálytartály, a nagynyomású szivattyú, az oszlop, az injektorrendszer és a detektor.
Detektálási határ |
Gáz ajánlás |
Regulátor ajánlás |
| Purge gáz | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 sorozat |
A tartályban található az oldószer, amelyet mozgó fázisnak nevezünk, mert mozog. Egy rendszerben általában legalább két tartály van, mindegyikben legfeljebb 1000 cm3 oldószer van, és általában gázdiffúzorral van felszerelve, amelyen keresztül héliumot lehet buborékosítani. A mozgófázis meghatározott áramlását szivattyúval állítják elő. Bár a minták kézi befecskendezése még mindig lehetséges, a legtöbb HPLC ma már teljesen automatizált és számítógéppel vezérelt. Az injektor vagy automatikus mintavevő az oldószert egy fázisáramba juttatja, amely a mintát a nagynyomású (akár 400 bar) oszlopba szállítja, amely az elválasztáshoz szükséges speciális töltőanyagot tartalmazza. A csomagolóanyagot helyhez kötött fázisnak nevezik, mivel az oszlop hardvere tartja a helyén.
Egy detektorra van szükség ahhoz, hogy az elválasztott vegyületsávokat a nagynyomású oszlopból való eluálásuk során láthassuk. Az információ a detektorról egy számítógéphez kerül, amely létrehozza a kromatogramot. A mobil fázis kilép a detektorból, és tetszés szerint vagy a hulladékba kerül, vagy összegyűjtésre.
A héliummal való befúvás hatékony módszer a mobilfázis gáztalanítására, hogy elkerüljük az oldott levegő okozta instabil alapvonalakat. A nitrogént porlasztógázként használják a párologtató fényszórásos detektorban (ELSD), ahol az oldószer elpárolog a mintából, és a mérés során ködöt hagy maga után.
Nagy teljesítményű folyadékkromatográfia – Egyéb HPLC-típusok
Ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfia (uHPLC):
Míg a standard HPLC általában 3 és 5 µm közötti méretű oszloprészecskéket és 400 bar körüli nyomást használ, az uHPLC speciálisan tervezett oszlopokat használ, amelyek részecskéinek mérete akár 1,7 µm is lehet, 1000 bar feletti nyomáson. Az uHPLC fő előnye a sebesség. Ezek a rendszerek gyorsabbak, érzékenyebbek, és kisebb mennyiségű szerves oldószert használnak, mint a hagyományos HPLC, ami azt eredményezi, hogy kevesebb idő alatt több mintát lehet lefuttatni. Ha azonban a rendszereket jellemzően 800 bar-nál nagyobb nyomáson működtetik, az oszlopok elöregednek, illetve gyorsabban degradálódnak. Újabb technológiát fejlesztenek ki az uHPLC-egységek számára, hogy 1 µm-es méretű oszloprészecskéket használjanak, és akár 6800 bar nyomáspotenciálra is képesek legyenek.
Az uHPLC a Waters Corporation védjegye, az UPLCTM néven is ismert.
Gyors fehérje folyadékkromatográfia (FPLC):
A FPLC a nagyteljesítményű folyadékkromatográfiához hasonló rendszer, amelyet fehérjék és más biomolekulák komplex keverékekből történő elválasztására vagy tisztítására használnak. Az FPLC és a HPLC közötti fő különbség a standard üzemi nyomás. Az FPLC oszlopok csak 3-5 MPa maximális nyomásig használhatók. Ha a HPLC nyomása korlátozható, akkor szinte minden FPLC oszlop használható egy HPLC rendszerben is.