Dose and Time Effects of Caffeine Intake on Human Platelet Adenosine A2A Receptors

A koffein, amely különböző forrásokban, például kávéban, teában, csokoládéban és kólaitalokban található, a legelterjedtebb hatóanyag a világon. A felnőtt emberek átlagos koffeinfogyasztása a különböző kultúrák és nemzetek között 80-400 mg/fő/nap között változik.1 A koffein sokféle farmakológiai választ vált ki, többek között fokozott éberséget, csökkent pszichomotoros reakcióidőt és megnövekedett alvási látenciát és ébrenléti időt, valamint befolyásolhatja a szellemi teljesítményt is.2 Ezenkívül a koffein a simaizmok ellazulását okozza, fokozza a gyomorsav kiválasztását és a katekolaminok felszabadulását, valamint növeli a metabolikus aktivitást.3

A koffein hatásainak hátterében álló pontos mechanizmus(ok) még kevéssé meghatározottak. Bár a foszfodiészterázok gátlása hozzájárulhat a koffein hatásaihoz,4 egyre több bizonyíték van arra, hogy e xantin legtöbb farmakológiai hatása az A1, A2A, A2B és A3 altípusokként megjelölt adenozinreceptorok antagonizmusából ered.5 A koffein a legerősebben az A2A receptorokon hat, szorosan utána az A1 receptorokon, majd az A2B receptorokon,6 és gyenge antagonistaként a humán A3 receptorokon. Az adenozinreceptorok, nevezetesen az A1 és az A2A receptortípusok koffeinnel történő blokkolása gátolja az endogén adenozin hatását számos élettani folyamatra.7 Normál körülmények között az adenozin vérszintje elegendőnek tűnik ahhoz, hogy tónusosan aktiválja a vérlemezkék A2A receptorait. Nemrégiben A2A-receptor-knockout egerekben arról számoltak be, hogy a vérlemezkék aggregációja fokozódott, ami jelzi ennek a receptor altípusnak a fontosságát a vérlemezkék működésében8. Elképzelhető tehát, hogy a koffein blokkolhatja ezeket a tónusosan aktivált A2A receptorokat a vérlemezkékben, és megváltoztathatja az adenozin által modulált funkcióikat.

A kávéfogyasztás és a szív- és érrendszeri betegségek, különösen a koszorúér-betegség között sokáig összefüggést gyanítottak,9 de nemrégiben bebizonyosodott, hogy a kávé- vagy koffeinfogyasztás nem növeli a koszorúér-betegségek vagy a stroke kockázatát.1011 Számos, a szívinfarktust figyelembe vevő epidemiológiai vizsgálat nem talált káros hatást a napi <5 csésze kávéfogyasztásnál, míg a magasabb beviteli szinteknél az eredmények ellentmondásosak.12 A magas vérnyomásban szenvedő betegeknél a koffeinbevitel semmilyen szintjén nem figyeltek meg káros kimenetelű kockázatot.13

Biaggioni és munkatársai14 vizsgálata szerint a koffein ismételt adagolása jelentős változásokat eredményez az emberi vérlemezkékben az 5′-N-etil-karboxamidoadenozin (NECA) adenozinreceptor-agonistára adott funkcionális válaszokban. A koffein megvonása az aggregáció NECA által kiváltott gátlásának jelentős balra tolódását eredményezte14. Ezzel összhangban nemrégiben kimutattuk,15 1 héten keresztül 750 mg/nap adaggal kezelt alanyokon, hogy a krónikus koffeinbevitel megváltoztatja a vérlemezkék aggregabilitását a vérlemezkék felszínén található A2A-receptorok upregulációja következtében.

Ezzel a cikkel további bizonyítékot szolgáltatunk arra, hogy hasonló válaszreakciót találunk különböző dózisú koffeinnel, például 1 héten keresztül 600 mg/nap vagy hosszabb ideig, például 2 hétig adagolt 400 mg/nap adaggal kezelt alanyoknál. Jelen vizsgálatban ezt az adenozin A2A-receptorok változásainak (sűrűség és affinitás) és működésének közvetlen mérésével tettük, meghatározva az A2A-szelektív agonista 2-hexinil-NECA (HE-NECA) hatását (1) a cAMP-felhalmozódás növelésére, (2) a vérlemezke-aggregáció gátlására és (3) az intracelluláris kalciumszint csökkentésére. Krónikus fogyasztást követően (600 mg/d 1 héten át vagy 400 mg/d 2 héten át) a vérlemezkék adenozin A2A receptorainak upregulációját találták, ami szoros korrelációban állt az antiaggregációs hatással, a cAMP-felhalmozódás emelkedésével és az intracelluláris kalciumszint csökkenésével. Az 1 héten keresztül 400 mg/nap adaggal kezelt alanyoknál nem mutattak ki különbséget a kötődési és funkcionális paraméterek tekintetében.

Módszerek

Negyvenöt egészséges, nemdohányzó, 25-45 éves, mindkét nembeli alanyt vizsgáltak. Az írásbeli tájékozott beleegyezést követően az alanyokat arra kérték, hogy ≥2 hétig tartózkodjanak az étrendi metilxantinoktól. A koffein beadási rendje (azaz a beadás dózisa és időtartama) szerint 3 csoportra osztották őket (egyenként 15 alany): 200 mg szájon át naponta kétszer 7 napon keresztül (1. csoport); 200 mg szájon át naponta kétszer 14 napon keresztül (2. csoport); és 200 mg szájon át naponta háromszor 7 napon keresztül (3. csoport). Ezen alanyok vérlemezkéit a koffein bevitele előtt (0. nap), valamint az utolsó koffeinadag után 1, 12, 60 és 108 órával vizsgálták. Különösen az 1 órás időpontot csak a maximális koffeinadagot (600 mg/nap) kapó csoportban vizsgálták. A funkcionális vizsgálatokban az EC50 és IC50 értékeket nem lehetett 1 óránál meghatározni a szűk időintervallumban (1-12 óra) történő túlzott vérvételhez kapcsolódó gyakorlati problémák miatt.

SCH 58261 kötődési vizsgálat humán vérlemezke-membránokban

A humán vérlemezkékből származó membránokat a korábban leírtak szerint készítették el16 és használták az SCH 58261 radioligand-kötési vizsgálatokhoz Varani et al.17 szerint. A telítési vizsgálatok során a humán vérlemezke-membránokat 8-10 különböző SCH 58261-koncentrációval inkubálták, amelyek koncentrációja 0,01 és 10 nmol/L között volt. A nemspecifikus kötődést 10 μmol/L NECA jelenlétében határoztuk meg. A 4°C-on történő 60 perces inkubáció után a mintákat Whatman GF/B szűrőkön keresztül szűrtük Micro-Mate 196 Cell Harvester (Packard Instrument Co) segítségével. A telítési kísérletek adatainak számítógépes elemzéséhez egy súlyozott nemlineáris legkisebb négyzetek görbeillesztő programot, a LIGAND-ot18 használtuk.

A cAMP-szintek mérése emberi vérlemezkékben

Az egészséges önkéntesek perifériás véréből nyert mosott emberi vérlemezkéket a korábban leírt módon készítettük el.16 A vérlemezkéket (6×104-8×104 sejt) 1,0 U adenozin-deaminázzal/ml, 0,5 mmol/l 4-(3-butoxi-4-metoxi-benzil)-2-imidazolidinonnal (Ro 20-1724) mint foszfodiészteráz-inhibitorral és 6-8 különböző koncentrációjú HE-NECA-val inkubáltuk. Az EC50 értékeket a koncentráció-válasz görbékből kaptuk a függő változók log-logit transzformációját követően, súlyozott legkisebb négyzetek módszerével.19 A végső vizes oldat cAMP-szintjét versenyfehérje-kötési próbával vizsgáltuk.15

Hrombocita-aggregációs próba

A trombocitákban gazdag plazma kinyeréséhez 200 g-nél 10 percig, a trombocitákban szegény plazma kinyeréséhez pedig 2500 g-nél 20 percig centrifugáltuk a citrált emberi vért. A humán trombocitaszámlálást Coulter Counter S8/80 modellben (Coulter Electronics Inc.) végeztük, és 2,5×108/ml és 3,5×108/ml közötti értékre állítottuk be az autológ vérlemezkeszegény plazmával. A vérlemezke-aggregációt a Born-féle turbidimetriás technika20 szerint végeztük DIC PA-3220 Aggrecorderrel (Kyoto Daiichi Kagatu Co). A HE-NECA 6-8 különböző koncentrációjával történő 3 perces inkubációt követően 37°C-on, folyamatos keverés mellett, ADP-vel folyamatos keverés mellett aggregáltuk a vérlemezkékben gazdag plazmát. Hasonló kísérleteket végeztünk különböző koncentrációjú ADP-vel (100 nmol/L-től 100 μmol/L-ig). Az ADP hozzáadása után 5 perccel rögzített maximális aggregációt használtuk a kvantitatív elemzéshez, és a gátlás százalékos arányát a kontroll értékekhez viszonyítva számoltuk ki.21

Citoplazmatikus szabad Ca2+ koncentráció mérése

A citoszolikus szabad kalcium koncentráció mérése a fura 2 technikával történt Paul és munkatársai szerint.22 Röviden, a vérlemezkéket teljes sötétségben 30 percig 37°C-on inkubáltuk 1 μmol/L fura 2-AM-mel, majd mágnesesen kevertettük fluoriméteres küvettákban (LS50, Perkin Elmer, Ltd.) 108/ml koncentrációban, 250 μmol/L szulfinpirazon jelenlétében. Az intracelluláris Ca2+ koncentrációt (i) 340/380 gerjesztési arány és 505 nm-es emissziós hullámhossz mellett határoztuk meg.

Statisztikai elemzés

Az adatok elemzését 1-utas ANOVA-val végeztük. A koffeinnel kezelt csoportok (12, 60 és 108 óra) és a kontrollszemélyek közötti különbségek elemzése Student’s t teszttel történt (párosítás nélküli elemzés). A különbségeket P<0,01 értéknél tekintettük szignifikánsnak. Minden adatot átlag±SEM-ben adunk meg.

Eredmények

A 3 alanycsoportból származó vérlemezkéket a koffein adagolásának megkezdése előtt (0. nap, kontroll) és az utolsó adagot követő 1, 12, 60 és 108 órával (koffeinmegvonás) gyűjtöttük. A táblázat a 3 alanycsoportból származó kötődési és funkcionális kísérletek eredményeit foglalja össze.

1. csoport (400 mg/d 1 hétig)

A kötődési paraméterek 105±6 fmol/mg fehérje kontroll Bmax értéket és 1,28±0,08 nmol/L KD értéket mutattak. Kontroll vérlemezkékben a HE-NECA 60±5 nmol/L EC50 értékkel növelte a cAMP-szintet, és gátolta (1) az aggregációt 86±10 nmol/L IC50 értékkel és (2) a kalciumszintet 104±8 nmol/L IC50 értékkel. A koffein megvonása után 12, 60 és 108 órával nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbségeket a kötődési és funkcionális paraméterekben (táblázat).

2. csoport (400 mg/d 2 hétig)

A kötődési paraméterek 110±3 fmol/mg fehérje kontroll Bmax értéket és 1,21±0,09 nmol/L KD értéket mutattak. A koffein megvonása után 12 és 60 órával a receptorsűrűség, a Bmax mindkét időpontban mintegy 20%-kal nőtt, de a KD értékek nem változtak. A funkcionális kísérletek kimutatták, hogy az adenozin A2A receptor agonista HE-NECA szignifikánsan erősebb volt a vérlemezkék cAMP-jának növelésében (azaz az EC50 értékek 45%-kal és 65%-kal kisebbek voltak 12 és 60 órával a koffein megvonása után, mint a kontroll értékek). Hasonló tendencia volt megfigyelhető az aggregációs kísérletekben és a citoplazmatikus szabad kalcium koncentráció mérések során kapott IC50 értékekben (táblázat).

3. csoport (600 mg/d 1 hétig)

Összességében a 2. csoportéhoz hasonló adatokat kaptunk. Az SCH 58261 a kontrollokból származó trombocita membránok egyetlen affinitású helyosztályához kötődött 100±4 fmol/mg fehérje Bmax értékkel és 1,27±0,09 nmol/L KD értékkel. Amint az 1A. ábrán látható, a koffein megvonása után 1, 12, 60 és 108 órával begyűjtött vérlemezkékből származó membránokban a radioligandum ugyanolyan affinitással kötődött, de a kötőhelyek száma (Bmax) szignifikánsan (P<0,01) megnőtt. Párhuzamos vizsgálatokban meghatározták a vérlemezkék funkcionális válaszait az A2A receptor agonistára, a HE-NECA-ra. Amint a táblázatban összefoglaltuk, a HE-NECA (1) cAMP-képződés növelésére, (2) az ADP-indukált trombocitaaggregáció gátlására és (3) a kalciumszint csökkentésére vonatkozó hatásossága szignifikánsan megnőtt a koffein megvonása után 12, 60 és 108 órával nyert trombocitákban (1B, 1C és 1D ábra). Kísérleteket végeztünk annak megállapítására is, hogy az A2A-receptorok sűrűségének növekedése együtt jár-e az ADP aggregációt kiváltó erejének és/vagy hatékonyságának csökkenésével. A koffein megvonása után 12, 60 és 108 órával az ADP trombocita-aggregációt serkentő EC50 értékei 0,7±0,2, 0,9±0,1 és 0,8±0,1 μmol/l voltak, amelyek nem különböztek jelentősen a 0,9±0,1 μmol/l értékektől.2 μmol/L értékektől, amelyeket a kontrollokból származó vérlemezkékben kaptunk (2. ábra).

Diszkusszió

A koffein hosszú távú adagolásának hatásai emberekben és állatokban, valamint a koffein hatásaival szembeni toleranciában betöltött szerepe ellentmondásos. Egyes vizsgálatok az A1 receptorok növekedését mutatták ki az egér agyában, és bizonyítékot találtak az A1 receptorok dózisfüggő felszabályozására a koffein hatására.23 Más vizsgálatok az A2A receptorok felszabályozását mutatták ki, ami a koffeinbevitel adaptív hatására utal.24 Továbbá a krónikus koffeinfogyasztás a vérlemezkék felszínén található A2A receptorok felszabályozása következtében a vérlemezkék aggregabilitásának csökkenéséhez vezethet14 , ami potenciális szerepet játszik a patofiziológiai folyamatokban, például az aggregációban és a trombogenezisben. Bár ezek a változások hozzájárulhatnak a vérlemezkefunkció változásaihoz, a koffeinnel szembeni tolerancia nem módosítja ennek a xantinnak mint az adenozin hatásainak kompetitív antagonistájának hatékonyságát.25 A tolerancia jelenségében más változások, mint például a receptoraffinitás eltolódása egy nagy affinitású állapotba, a G fehérje szintjének vagy e fehérjéknek az adenozinreceptorokhoz való kapcsolódásának megváltozása vagy a receptorok hosszú távú foglaltsága is szerepet játszhat.26 A koffeinnel szembeni elvonási tünetek előfordulnak emberekben; jellemzően fejfájás, fáradtság, apátia és álmosság.9 Különösen a koffein növeli a plazma adenozinkoncentrációját, és annak csökkenése az antagonista megvonását követően a plazma adenozinkoncentrációjának receptor-közvetített szabályozására utal.27 Ischaemia és/vagy hipoxia során az adenozinnak neuroprotektív hatása is van. Felnőtt agyban a krónikus koffeinkezelés, amely az adenozinreceptorok upregulációjához vezet, csökkenti az ischaemiás károsodást, míg az akut expozíció (receptorantagonista hatás) növeli az ischaemiás károsodást.28

Kimutatták, hogy a krónikus koffeinbevitel megváltoztatja a vérlemezkék válaszát az adenozin hatására.14 A koffein ismételt adagolása (750 mg/d 1 héten keresztül) az A2A receptor sűrűségének növekedését mutatta ki, amit a vérlemezkék válaszainak szenzitizálódása kísért, mint például a cAMP felhalmozódás növekedése és a vérlemezkeaggregáció csökkenése.15 Jelen vizsgálat célja az volt, hogy meghatározzuk a koffein dózisának és az adagolás időtartamának hatását a kötődési és funkcionális paraméterekre. Ezért megvizsgáltuk az adenozin A2A receptorok sűrűségének és affinitásának változásait a különböző dózisú (400 vagy 600 mg/d) koffeinbevitellel különböző ideig (1 vagy 2 hét) kezelt személyek humán trombocita membránjaiban. Konkrétan kontroll (koffein beadása előtt) és koffeinnel kezelt (1, 12, 60 és 108 órával az utolsó koffeinadag után) alanyokat vizsgáltunk.

A 400 mg/d koffeinnel 1 héten át végzett kezelés nem módosította az A2A-receptorok kötődését és funkcionális paramétereit. A 2 héten át 400 mg/d vagy 1 héten át 600 mg/d kezelés azonban (1) az adenozin A2A kötőhelyek jelentős növekedését (upregulációját), (2) a cAMP felhalmozódásának növekedését, (3) az antiaggregációs hatások növekedését és (4) az A2A receptor agonista HE-NECA által kiváltott kalciumszint csökkenését eredményezte.

Az A2A receptorok upregulációja valószínűleg az új receptorok szintézisének tulajdonítható a prekurzor sejtek differenciációja során. Ez az értelmezés azon in vitro kísérletek eredményein alapul, amelyek azt mutatják, hogy kontrollszemélyek vérlemezkékben gazdag plazmájának 6 vagy 12 órán át tartó inkubálása koffeinnel vagy SCH 58261-gyel nem befolyásolta a kötődési paramétereket.15 Az adenozin A2A receptorok krónikus koffeinbevitel okozta upregulációját úgy lehet értelmezni, hogy az endogén adenozin tonizáló hatással van a humán vérlemezkékre, és az antagonista jelenlétét ellensúlyozza az A2A receptorok upregulációja. Felnőtteknél a koffein hatékonyan adszorbeálódik a gasztrointesztinális traktusból; a plazma csúcskoncentrációja 15-120 perccel a lenyelés után jelentkezik, és a koffein felezési ideje 2,5-4,5 óra7. Az adenozin A2A-receptorok 1 órával a koffeinkezelés utolsó adagja után tapasztalt növekedése hasonló volt a koffein megvonása után 12 vagy 60 órával tapasztaltakhoz, ami azt mutatja, hogy a megvonás nem volt szükséges az A2A-receptorok felszabályozásához.

A jelen vizsgálat másik célja annak meghatározása volt, hogy a kötődési paraméterekben bekövetkezett változások korrelálnak-e a funkcionális válasz(ok) változásaival. Azt találtuk, hogy a vérlemezke-aggregáció az adenilát-cikláz aktivációjával és az intracelluláris kalciumkoncentráció emelkedésével járt együtt. A HE-NECA hatásossága 12, 60 és 108 órával a koffein megvonása után szignifikánsan megnőtt a kontrollcsoporthoz képest. Ez a megállapítás arra utal, hogy a különböző dózisú koffein ismételt adagolása jelentős változásokat eredményez a vérlemezkék felszínén lévő A2A-receptorok számában, amit a receptorstimulációra való fokozott érzékenység kísér. A klasszikus adenozin A2A receptor felelős az adenozin és analógjai antiaggregációs tulajdonságaiért, ami összhangban van azzal a megfigyeléssel, hogy az aggregáció hatékonyabb az A2A receptorok hiányát mutató egerekben.8 Az ADP növekvő koncentrációi által kiváltott trombocita-aggregáció azonban nem különbözött jelentősen a kontroll és a koffeinnel kezelt alanyok között. Ez utóbbi megfigyelés egyik lehetséges magyarázata az, hogy a vizsgálati közegben nincs elég adenozin a válasz kiváltásához. Másik lehetőség, hogy a koffeinnel kezelt alanyokban a receptor-felszabályozás mértéke (azaz a receptorok száma) nem volt elegendő ahhoz, hogy az ADP-indukált aggregáció koncentráció-válasz görbéjének eltolódását okozza. Amikor azonban az endogén adenozin szintje megnő, mint például a szívizom iszkémiája során, az adenozin extracelluláris koncentrációja gyorsan olyan szintre emelkedik, amely elegendő ahhoz, hogy a felszabályozott receptorokra hasson, és a kontrollnál nagyobb trombocita-gátló hatást fejthet ki. Így lehetséges, hogy a krónikus koffeinfogyasztás az átlagos étrendi beviteltől nem messze eső dózisokban paradox módon csökkenti a vérlemezkék aggregabilitását iszkémiában.

Összefoglalva, az összes adat együttesen újabb bizonyítékot szolgáltat arra, hogy a krónikus koffeinfogyasztás megváltoztatja a vérlemezkék válaszát az adenozin hatására. A jelen vizsgálat legfontosabb megállapítása, hogy a krónikus koffeinfogyasztás trombocita funkciókra gyakorolt hatása mind a dózistól, mind a kezelés időtartamától függ, és az adenozin A2A-receptorok upregulációja miatt a trombocita aggregabilitás csökkenésének hátterében áll.

Lábjegyzetek