DNS-replikáció és rekombináció

“Bár a tények eleve kevésbé kielégítőek, mint a belőlük levont intellektuális következtetések, fontosságukat soha nem szabad megkérdőjelezni.” James D. Watson, 2002.

A DNS hordozza az élet összes genetikai információját. Egyetlen hatalmas hosszú DNS-molekula alkotja egy szervezet minden egyes kromoszómáját, egy embernél 23-at. Az alapvető élő egység az egyetlen sejt. Egy sejtből a sejtosztódásnak nevezett folyamat sorozatos ismétlődésével több sejt keletkezik. Minden egyes osztódás előtt a sejtet alkotó számos molekula mindegyikéről új másolatot kell készíteni, beleértve az összes DNS-molekula megkettőződését is. DNS-replikációnak nevezik ezt a duplikációs folyamatot, amely lehetővé teszi, hogy a szervezet genetikai információi – génjei – továbbadódjanak a sejtosztódáskor létrejövő két leánysejtnek. Az élet szempontjából csak valamivel kevésbé központi jelentőségű egy dinamikus DNS-akrobatikát igénylő folyamat, az úgynevezett homológ DNS-rekombináció, amely a kromoszómákon lévő géneket átrendezi. A DNS-replikációhoz szorosan kapcsolódó reakciók során a rekombinációs gépezet javítja a sejtek hosszú, törékeny DNS-molekuláinak elkerülhetetlenül bekövetkező sérüléseit is (lásd Friedberg cikkét ebben a számban, 436. oldal).

A James Watson és Francis Crick által javasolt DNS-kettős spirálx1 modellje két páros DNS-szálon alapul, amelyek nukleotidsorrendje komplementer. A modellnek markáns következményei voltak a DNS-replikáció és a DNS-rekombináció folyamataira. 1953 előtt még csak találgatni sem lehetett e két központi genetikai folyamat molekuláris mechanizmusáról. Az a javaslat azonban, hogy a DNS egyik szálának minden egyes nukleotidja szorosan bázispárosodott az ellentétes szálon lévő komplementer nukleotidjával – adenin (A) és timin (T) vagy guanin (G) és citozin (C) – azt jelentette, hogy a nukleotidszekvencia bármely része közvetlen mintaként szolgálhat a másik szál megfelelő részének. Ennek eredményeként a szekvencia bármelyik része felhasználható a partner nukleotidszekvencia létrehozására vagy felismerésére – ez a két funkció központi szerepet játszik a DNS-replikációban, illetve a DNS-rekombinációban.

Ebben az áttekintésben azt tárgyalom, hogy a DNS szerkezetének fél évszázaddal ezelőtti felfedezése hogyan nyitott új utakat a DNS-replikáció és a rekombináció folyamatainak megértéséhez. Azt is hangsúlyozni fogom, hogy ahogy az évek során egyre jobban megértettük a komplex biológiai molekulákat és kölcsönhatásaikat, mélyreható változások történtek abban, ahogy a biológusok az élet kémiájára tekintettek.

A DNS szerkezeti jellemzői

A kettős spirál felfedezését közvetlenül követő kutatások elsősorban a molekula szerkezeti tulajdonságainak megértésére összpontosítottak. A DNS a génátírás folyamatán keresztül meghatározza az RNS-t, az RNS-molekulák pedig a sejt összes fehérjét. Ez a genetikai információátvitel “központi dogmája “2 . A genetikai információ bármilyen kiolvasása – akár a DNS-replikáció, akár a génátírás során – megköveteli a kettős spirál belsejében eltemetett bázisok sorrendjéhez való hozzáférést. A DNS-szálak szétválasztása ezért kritikus fontosságú a DNS működése szempontjából. Ezért a Watson-Crick-modell arra késztette a tudósokat, hogy olyan körülményeket keressenek, amelyek megszakítják a komplementer bázispárokat összekötő hidrogénkötéseket, és így szétválasztják a DNS kettős spirál két szálát.

A fizikai kémikusok megállapították, hogy a DNS-oldat forráspont közeli hőmérsékletre (100 °C) való melegítése vagy szélsőséges pH-értékek alá helyezése a szálak szétválását eredményezi – ezt a változást “DNS denaturációnak” nevezik. Egy DNS-szekvencia úgynevezett “olvadási hőmérséklete” (vagy Tm) a nukleotid-összetételtől függ: a G-C bázispárokat nagyobb arányban tartalmazó DNS-ek Tm értéke magasabb, mivel Watson és Crick szerint a G-C bázispárokat három hidrogénkötés tartja össze, míg az A-T bázispárok esetében csak kettő. Fiziológiás sókoncentrációban az emlős DNS Tm-je közel 90 °C, ami a bázispárok sajátos keverékének köszönhető (47% G-C és 53% A-T)3.

Eredetileg elképzelhetetlennek tűnt, hogy a komplementer partnerétől egyszer elválasztott DNS-szál újra kettős spirált alkosson. A DNS-molekulák bonyolult keverékében egy ilyen mutatványhoz a többi szekvenciával való véletlenszerű ütközések során milliónyi szekvencia között kellene megtalálni az egyetlen egyezést, majd gyorsan visszatekeredni egy új partnerszállal. A “DNS-renaturációnak” nevezett váratlan jelenség4 drámai felfedezése rávilágított arra, hogy a szekvenciák hogyan rendeződhetnek át DNS-rekombináció révén. Egyúttal a DNS laboratóriumi manipulálásának kritikus eszközét is biztosította. A komplementer nukleotidszekvenciák egymáshoz kapcsolódása, a hibridizációnak nevezett folyamat, számos olyan DNS-technológia alapját képezi, amely hozzájárult a biotechnológiai ipar és a modern genomika elindításához. Ezek közé tartozik a gének klónozása, a genomiális szekvenálás és a DNS polimeráz láncreakcióval történő másolása (lásd Hood és Galas cikkét a 444. oldalon).

A DNS-molekulák kromoszómákban való elrendezése újabb rejtélyt jelentett a tudósok számára: egy hosszú, vékony molekula rendkívül érzékeny lenne a nyírás okozta törésre, és nehéz volt elképzelni, hogy egy emlős kromoszóma csak egyetlen DNS-molekulát tartalmazzon. Ehhez az kellene, hogy egy tipikus kromoszóma egy több mint 100 millió nukleotidpárt meghaladó, összefüggő DNS-hélixből alakuljon ki – egy több mint 100 milliárd daltont nyomó, masszív molekulából, amelynek a végétől a végéig több mint 3 cm a távolság. Hogyan lehetne egy ilyen óriási molekulát egy mindössze mikron átmérőjű sejtben megóvni a véletlen széttöredezéstől, miközben a hatékony génkiolvasás és más genetikai funkciók érdekében szervezetten tartható?

A biológia világán kívül nem volt példa ilyen óriási molekulákra. Az 1960-as évek elején azonban autoradiográfiás vizsgálatok kimutatták, hogy az Escherichia coli baktérium kromoszómája valójában egyetlen, több mint 3 millió nukleotidpár hosszúságú DNS-molekula5. És amikor – több mint egy évtizeddel később – innovatív fizikai technikákkal bebizonyították, hogy egyetlen hatalmas DNS-molekula képezi minden egyes emlős kromoszóma alapját6, az eredményt a tudósok kevés meglepetéssel fogadták.

DNS-replikációs villák

Hogyan másolódik pontosan a kromoszómát alkotó, rendkívül hosszú, kettős szálú DNS-molekula, hogy minden sejtosztódáskor egy második, azonos kromoszómát hozzon létre? A DNS-replikáció sablonmodellje, amelyet Watson és Crick javasolt 1953-ban (7. hivatkozás), az 1950-es évek végén két felfedezés után vált általánosan elfogadottá. Az egyik egy elegáns kísérlet volt, amely sűrűségjelzett bakteriális DNS-eket használt, és amely megerősítette a megjósolt sablon-anti-sablon sémát8. A másik a DNS-polimeráz nevű enzim felfedezése volt, amely a DNS egyik szálát sablonként használja egy új, komplementer szál szintéziséhez9. Négy dezoxiribonukleozid-trifoszfát nukleotid – dATP, dTTP, dGTP és dCTP – az új leány DNS-szál előfutárai, minden egyes nukleotid a szülői sablonszál komplementer nukleotidjával (T, A, C, illetve G) való párosítás révén kerül kiválasztásra. Kimutatták, hogy a DNS-polimeráz ezeket a trifoszfátokat arra használja, hogy az újonnan szintetizált DNS-molekula 3′ végéhez egyesével nukleotidokat adjon hozzá, ezáltal katalizálva a DNS-lánc növekedését az 5′-3′ kémiai irányban.

Noha a rövid DNS-szekvencia szakaszok szintézisét egyszálú sablonon kémcsőben be lehetett mutatni, az, hogy hogyan replikálódik egy hatalmas, csavart, kétszálú DNS-molekula, rejtély volt. A sejt belsejében megfigyelték, hogy a DNS-replikáció egy Y alakú szerkezetnél, az úgynevezett “replikációs villánál” történik, amely egyenletesen halad egy szülői DNS-hélix mentén, és mögötte két leány DNS-hélixet fon ki (az “Y” két karját)5 . Ahogy azt Watson és Crick megjósolta, a kettős spirál két szála ellentétes kémiai irányban fut. Ezért a replikációs villa mozgása során a DNS-polimeráz csak az Y egyik karja mentén tud folyamatosan mozogni – azon a karon, amelyen az új leányszál az 5′-3′ kémiai irányban megnyúlik. A másik karon az új leányszálat az ellenkező, 3′-5′ kémiai irányban kellene létrehozni (1a. ábra). Míg tehát Watson és Crick központi előrejelzései a mérföldkőnek számító felfedezésüket követő első évtized végére beigazolódtak, a DNS-replikáció folyamatának részletei rejtély maradtak.

A replikáció rekonstruálása

A rejtélyt a következő két évtized során sikerült megoldani, ebben az időszakban azonosították a DNS-replikációs folyamat központi szereplőit alkotó fehérjéket. A tudósok különböző kísérleti módszereket alkalmaztak a DNS-replikáció szempontjából kritikusnak vélt géntermékek egyre bővülő halmazának azonosítására. Például olyan mutáns szervezeteket azonosítottak, amelyekben a DNS-replikáció hibás volt, majd genetikai módszerekkel azonosítani lehetett a replikációs folyamathoz szükséges gének meghatározott csoportjait10,11,12 . Az e gének által meghatározott fehérjék segítségével “sejtmentes” rendszereket hoztak létre, ahol a folyamatot tisztított komponensek felhasználásával in vitro újra létrehozták. Kezdetben a fehérjéket “részleges replikációs reakcióban” vizsgálták, ahol a teljes replikációs folyamathoz szükséges fehérje-gépezetnek csak egy részhalmaza volt jelen, és a DNS-templát egyszálú formában biztosították13. Az azonosított új fehérjéket egyenként vagy kombinációban adták hozzá, hogy teszteljék a DNS-polimeráz katalitikus aktivitására gyakorolt hatásukat. A replikáció megértésében elért további előrelépések ezután bonyolultabb in vitro rendszerek létrehozásától függtek, amelyekben nagyobb mennyiségű tisztított fehérje hozzáadásával végül kétszálú DNS-t lehetett replikálni14,15.

Ma már szinte minden sejteken belüli folyamatot – a DNS-replikációtól és rekombinációtól a membránhólyagok szállításáig – tisztított összetevőkből rekonstruált in vitro rendszerben tanulmányoznak. Az ilyen rendszerek létrehozása ugyan munkaigényes, de lehetővé teszi az egyes komponensek koncentrációjának és részletes szerkezetének pontos szabályozását. Ráadásul a természetes rendszerben a mellékreakciók által okozott “zaj” – mivel a sejtben a legtöbb molekula egynél többféle reakcióban vesz részt – elkerülhető a többi reakciót katalizáló fehérjék eltávolításával. Lényegében a sejt egy kis töredékét kémiai reakciók korlátozott halmazaként lehet újraalkotni, ami teljes mértékben lehetővé teszi a pontos vizsgálatot a fizika és a kémia összes eszközével.

1980-ra a több fehérjéből álló in vitro rendszerek lehetővé tették a replikációs gépezet részletes jellemzését, és megoldották azt a problémát, hogy hogyan szintetizálódik a DNS a replikációs villa mindkét oldalán (1b. ábra). A “vezető szálon” mozgó DNS-polimeráz molekula folyamatosan szintetizál egy leány DNS-szálat, míg egy második DNS-polimeráz molekula a “lemaradó szálon” fragmentumok hosszú sorozatát (az úgynevezett Okazaki-fragmentumokat)16 állítja elő, amelyeket a DNS-ligáz enzim köt össze, hogy egy folyamatos DNS-szálat hozzon létre. Amint az várható volt, a vezető és a késleltetett DNS-szál szintéziséhez szükséges fehérjék között különbség van (lásd az 1. keretes írást). Figyelemre méltó, hogy az ezekben a mesterséges rendszerekben kialakult replikációs villákról kimutatták, hogy ugyanolyan gyors sebességgel mozognak, mint a sejtekben lévő villák (500-1000 nukleotid/másodperc), és a DNS-templát hihetetlenül nagy hűséggel másolták15.

Amint egyre több fehérjéről derült ki, hogy a replikációs villában működik, összehasonlításokat lehetett végezni a különböző organizmusok replikációs gépezete között. A vírusok, baktériumok és eukarióták replikációs gépezetének tanulmányozása során kiderült, hogy az egyes organizmusok replikációs villáit közös fehérjeaktivitások vezérlik (1. keretes írás). Mindegyik rendszer a következőkből áll: egy vezető- és egy késleltetett szálú DNS-polimeráz molekula; egy DNS-primáz, amely az egyes Okazaki-fragmentumokat indító RNS-primereket állítja elő; egyszálú DNS-kötő fehérjék, amelyek bevonják a sablon DNS-t és a helyén tartják; egy DNS-helikáz, amely a kettős hélixet feltekeri; és további polimeráz-kiegészítő fehérjék, amelyek a polimerázokat egymáshoz és a DNS-templáthoz kötik. Az egyszerű vírusoktól az összetettebb szervezetek, például az élesztők vagy az emlősök felé haladva az egyes fehérjeaktivitást alkotó alegységek száma általában növekszik. Például a replikációs apparátus magját alkotó polipeptid alegységek száma a T7 és T4 bakteriofágokban található négyről, illetve hétről 13-ra nő az E. coli baktériumban. A Saccharomyces cerevisiae élesztőben és az emlősökben pedig legalább 27-re bővül. Így, ahogy a nagyobb genommal rendelkező organizmusok fejlődtek, a replikációs gépezet új fehérje alegységekkel bővült, anélkül, hogy az alapvető mechanizmusok megváltoztak volna15,18,19,20.

Mialatt a DNS-replikációval kapcsolatos, általam leírt munkák haladtak előre, más kutatócsoportok olyan in vitro rendszereket hoztak létre, amelyekben a homológ DNS-rekombinációt rekonstruálni lehetett. E reakciók központi szereplője a RecA típusú fehérje17 volt, amelyet a rekombinációban hibás bakteriális mutánsról neveztek el, amely felfedezéséhez vezetett (2. keretes írás).

Fehérjegépek

A sejtbiokémia minden más aspektusához hasonlóan a DNS-replikációs apparátus is évmilliárdok alatt fejlődött ki “próba és hiba” útján – azaz véletlenszerű variáció, majd természetes szelekció révén. Idővel egyik fehérjét a másik után lehetett hozzáadni a replikációs villánál aktív fehérjék keverékéhez, feltehetően azért, mert az új fehérje növelte a teljes replikációs folyamat sebességét, irányítását vagy pontosságát. Ezenkívül az egyes fehérjék szerkezetét olyan mutációkkal finomhangolták, amelyek az aminosav-szekvenciát úgy változtatták meg, hogy az növelje a hatékonyságát. Ennek a szokatlan mérnöki folyamatnak a végeredményei azok a replikációs rendszerek, amelyeket ma a különböző szervezetekben megfigyelhetünk. A DNS-replikáció mechanizmusa tehát várhatóan nagymértékben függ a véletlenszerű múltbeli eseményektől. De vajon az evolúció azt választotta ki, ami működik, és nem volt szükség az eleganciára?

A Watson és Crick felfedezése utáni első 30 évben a legtöbb kutató úgy tűnt, azt a nézetet vallja, hogy a sejtek folyamatai lehetnek hanyagok. Ezt a nézetet a molekuláris szintű mozgások óriási sebességére vonatkozó ismeretek ösztönözték (például tudták, hogy egy tipikus fehérje másodpercenként körülbelül 106-szor ütközik egy 1 mM koncentrációban jelenlévő második molekulával). A molekuláris mozgások gyors sebessége kezdetben úgy gondolták, hogy egy olyan folyamat, mint a DNS-replikáció, a résztvevő fehérjék háromdimenziós térben való szerveződése nélkül is végbemehet.

Éppen ellenkezőleg, a molekuláris biológusok ma már elismerik, hogy az evolúció a rendkívül rendezett rendszereket választotta ki. Így például nemcsak a replikációs gépezet részeit tartják precíz elrendezésben egymás mellett, hogy optimalizálják kölcsönös kölcsönhatásaikat, hanem a fehérjék konformációjának energia által vezérelt változásait is felhasználják az összehangolt mozgások létrehozásához. Ez biztosítja, hogy egy olyan összetett folyamat, mint a DNS-replikáció, minden egyes egymást követő lépése szorosan összehangolt legyen a következővel. Az eredmény egy olyan összeállítás, amely egy “fehérjegépezetnek” tekinthető. Például a replikációs villa késleltetett oldalán lévő DNS-polimeráz molekula a vezető szálú DNS-polimeráz molekulához kötődve marad, hogy ugyanazt a késleltetett szálú polimerázt használja újra és újra az Okazaki-fragmentumok hatékony szintéziséhez18,20,21 (1. keretes írás). A DNS-replikáció pedig korántsem egyedülálló. Ma már úgy véljük, hogy szinte minden biológiai folyamatot tíz vagy több, térben elhelyezkedő, kölcsönhatásban lévő fehérje katalizál, amelyek egy gépszerű összeállításban22 nagymértékben rendezett mozgást végeznek.

A fehérjegépek általában meghatározott helyeken, meghatározott jelzésekre reagálva alakulnak ki, és ez különösen igaz a DNS-re ható fehérjegépekre. A DNS kettős spirál replikációját, javítását és rekombinációját gyakran különálló, elszigetelt folyamatoknak tekintik. A sejt belsejében azonban ugyanaz a DNS-molekula e reakciók bármelyikén képes végbemenni. Sőt, a háromféle reakció sajátos kombinációi is előfordulnak. A DNS-rekombinációt például gyakran közvetlenül összekapcsolják a DNS-replikációval vagy a DNS-javítással23. A kromoszóma integritásának megfelelő fenntartásához minden egyes specifikus reakciót gondosan irányítani és ellenőrizni kell. Ehhez az szükséges, hogy a fehérjekészletek a DNS-en összeálljanak, és csak ott és akkor aktiválódjanak, ahol és amikor szükség van rájuk. Bár még sokat kell tanulni arról, hogy ezek a döntések hogyan születnek, úgy tűnik, hogy a különböző típusú DNS-szerkezeteket kifejezetten speciális fehérjék ismerik fel, amelyek “összeszerelési faktorokként” szolgálnak. Minden egyes összeszerelési faktor aztán arra szolgál, hogy a sejtben az adott időnek és helynek megfelelő reakció katalizálásához szükséges fehérjék egy adott fehérjegépezetet alkotó fehérjekészlet kooperatív összeszerelését elindítsa.

A jövőbe tekintve

A tankönyvekben és a rendszeres tudományos irodalomban is szokássá vált, hogy a molekuláris mechanizmusokat egyszerű kétdimenziós rajzokkal vagy “karikatúrákkal” magyarázzák. Az ilyen rajzok hasznosak nagy mennyiségű adat egyszerű sémába történő összevonására, amint azt ez az áttekintés is szemlélteti. A biológusok egy egész generációja azonban abba a hitbe ringathatta magát, hogy egy biológiai mechanizmus lényegét megragadta, és így az egész problémát megoldotta, amint a kutató eléggé megfejtette a rejtvényt ahhoz, hogy képes legyen egy ilyen értelmes karikatúrát rajzolni.

Az elmúlt néhány évben teljesen világossá vált, hogy sokkal többre lesz szükség a tudósoktól, mielőtt azt állíthatjuk, hogy teljesen megértünk egy olyan folyamatot, mint a DNS-replikáció vagy a DNS-rekombináció. A közelmúlt genomszekvenálási projektjei, a fehérje-kölcsönhatások feltérképezésére irányuló erőfeszítések és a sejtszignálok tanulmányozása sokkal több komponenst és molekuláris kölcsönhatást tárt fel, mint amennyire korábban gondoltunk. Egy nemrégiben végzett elemzés szerint például az S. cerevisiae, egy egysejtű “egyszerű” eukarióta szervezet (amely körülbelül 6000 génnel rendelkezik, szemben az ember 30 000 génjével) 88 gént használ a DNS-replikációhoz és 49 gént a DNS-rekombinációhoz24.

A DNS-replikációra összpontosítva, a mechanizmus teljes megértéséhez vissza kell térnünk oda, ahol a DNS tanulmányozása először kezdődött – a kémia és a fizika területére. Az összes releváns fehérje és nukleinsav részletes atomszerkezetére szükség lesz, és az egyre nagyobb teljesítményű röntgenkrisztallográfiának és a nukleáris mágneses rezonancia technikáknak köszönhetően a strukturális biológusok látványos fejlődést értek el. De az a képesség, hogy a biológiai folyamatokat kémcsőben rekonstruáljuk olyan molekulákkal, amelyeknek a pontos szerkezete ismert, nem elégséges. A replikációs folyamat egyszerre nagyon gyors és hihetetlenül pontos, a végső hibaarány körülbelül egymilliárdból egy nukleotid. Annak megértéséhez, hogy a sok különböző fehérje és más molekulák közötti reakciók hogyan hangolódnak össze az eredmény létrehozásához, a kísérletezőknek meg kell határozniuk a különböző összetevők közötti kölcsönhatások összes sebességi állandóját, amit ma a molekuláris biológusok ritkán tesznek meg. Ezután géntechnológiai módszerekkel megváltoztathatják e paraméterek kiválasztott csoportjait, és gondosan nyomon követhetik e változások hatását a replikációs folyamatra.

A tudósok csak akkor állíthatják, hogy valóban megértik az olyan összetett folyamatot, mint a DNS-replikáció, ha pontosan meg tudják jósolni a különböző sebességi állandók változásainak hatását a teljes reakcióra. Mivel a kísérleti manipulációk skálája óriási, erőteljesebb módszerekre lesz szükségünk annak eldöntésére, hogy mely ilyen változtatások növelik leginkább a megértésünket. Ezért a számításos biológia gyorsan fejlődő területéről új megközelítéseket kell kidolgozni – mind a kísérletek irányítására, mind az eredmények értelmezésére.

A DNS Watson-Crick modellje drámai előrelépést katalizált a biológia molekuláris megértésében. Ugyanakkor hatalmas sikere azt a félrevezető nézetet keltette, hogy a biológia számos más összetett aspektusát is hasonlóan elegáns egyszerűségre lehetne redukálni éleslátó elméleti elemzéssel és modellépítéssel. Ez a nézet az elkövetkező évtizedek során háttérbe szorult, mivel a legtöbb biológiai alrendszerről kiderült, hogy túlságosan összetett ahhoz, hogy részleteiket meg lehessen jósolni. Ma már tudjuk, hogy semmi sem helyettesítheti a szigorú kísérleti elemzéseket. De a hagyományos molekuláris és sejtbiológia önmagában nem képes lezárni egy olyan problémát, mint a DNS-replikáció. Új típusú megközelítésekre lesz szükség, amelyek nemcsak új számítási eszközöket, hanem a kémia és a fizika fokozottabb integrációját is magukban foglalják20,25 . Ezért sürgősen át kell gondolnunk a biológiai tudósok következő generációjának oktatását22,26.

.