A felnőtt emberi szív sejtjei

Adatok jelentése

A mintanagyság előzetes meghatározására nem használtunk statisztikai módszereket. A kísérleteket nem randomizálták, és a vizsgálók nem voltak vakok az allokációra a kísérletek és az eredmények értékelése során.

A donorszövetek kutatási etikája

A szívszöveteket (D1-D7 és D11 donorok) a Wellcome Sanger Institute-ban (Hinxton, Egyesült Királyság) dolgozták fel, és elhunyt transzplantációs szervdonoroktól nyerték, miután a Kutatási Etikai Bizottság jóváhagyta (ref 15/EE/0152, East of England Cambridge South Research Ethics Committee) és a donor családok beleegyezését adták. A szívszöveteket (H2-H7 donorok) a Harvard Medical Schoolban (Boston, Massachusetts, USA) dolgozták fel, és elhunyt szervdonoroktól nyerték a Humán Kutatási Etikai Bizottság Pro00011739 jóváhagyását követően (University of Alberta, Edmonton, Kanada). A donorcsaládok tájékozott beleegyezését az intézményi Human Organ Procurement and Exchange Program (HOPE) keretében szerezték be. A kardiovaszkuláris anamnézis minden donor esetében rendben volt (1. kiegészítő táblázat).

Szövetnyerés és feldolgozás

A szöveteket brit és észak-amerikai donoroktól (D1-7 és 11, H2-7) keringési halál (DCD) (D2, D4-D7 és D11) és agyhalál (DBD) (D1, D3, H2-H7) után nyertük. A brit DCD donorok esetében ötperces várakozás után és a DBD esetében a mellkast kinyitják, az aortát keresztbefogják, és szívmintákat vesznek. Észak-amerikai DBD donorok esetében az aortát keresztbefogják, hideg kardioplegiát (Celsior) adnak be nyomás alatt az aortán keresztül a szívverés leállítása érdekében, a szívet kivágják, hideg sóoldattal öblítik és mintát vesznek. Minden donor mintája teljes vastagságú szívizombiopszia volt a bal és a jobb pitvarból, a bal és a jobb kamrából, az interkamrai septumból és az apexből, a nagy epikardiális zsírlerakódások szándékos kizárásával. Az egyes sejtmagok izolálásához használt mintákat gyorsfagyasztottuk és -80 °C-on tároltuk. Az egysejtűek izolálását és a CD45+ dúsítást frissen gyűjtött mintákon végeztük. A sejtmag- és sejtizolálási eljárások után megmaradt szöveteket formalinban fixáltuk vagy OCT-ben fagyasztottuk további vizsgálatokhoz.

A transzkripciós degradáció minimalizálása érdekében minden szövetet fagyasztásig vagy a szövetek szétválasztásáig mindig jégen tároltunk és szállítottunk. A GTEx konzorcium tömeges szöveteken68 és egyes sejteken69 végzett korábbi vizsgálatok a halál utáni szöveti stabilitásról azt mutatják, hogy a szövetekben csak kisebb változások történtek a halál utáni első 24 órában, ha azokat hideg körülmények között tárolták.

Egyetlen sejtmagok izolálása

Az egyes sejtmagokat gyorsfagyasztott szövetekből nyertük mechanikus homogenizálással, a korábban leírtak szerint70. A szöveteket egy 7 ml-es üveg Dounce szövetdaráló készlet (Merck) segítségével homogenizáltuk 8-10 ütés laza pisztollyal (A) és 8-10 ütés szoros pisztollyal (B) homogenizáló pufferben (250 mM szacharóz, 25 mM KCl, 5 mM MgCl2, 10 mM Tris-HCl, 1 mM ditiotreitol (DTT), 1× proteáz inhibitor, 0. A szöveteket homogenizáltuk.4 U μl-1 RNaseIn, 0,2 U μl-1 SUPERaseIn, 0,1% Triton X-100 nukleázmentes vízben). A homogenátumot 40 μm-es sejtszűrőn (Corning) keresztül szűrtük. Centrifugálás (500 g, 5 perc, 4 °C) után a felülúszót eltávolítottuk, és a pelletet tároló pufferben (1× PBS, 4% szarvasmarha szérumalbumin (BSA), 0,2 U μl-1 Protector RNaseIn) reszuszpendáltuk. A sejtmagokat NucBlue Live ReadyProbes Reagenssel (ThermoFisher) festettük, és a Hoechst-pozitív egyedi sejtmagokat fluoreszcens aktivált sejtválogatással (FACS) tisztítottuk influx, XDP vagy FACSAria (BD Biosciences) segítségével (1. kiegészítő ábra). A sejtmagok tisztítását és integritását mikroszkóp alatt ellenőriztük, majd a sejtmagokat a Chromium Controller (10X Genomics) segítségével dolgoztuk fel a gyártó protokolljának megfelelően.

Egysejtes preparáció

Szívszövetek (0.2-0,9 g) a kardioplegikus oldatból szelídMACS C-csövekbe (Miltenyi Biotec) kerültek, amelyek enzimes emésztési alapoldatot (100 μg ml-1 liberáz TH Research grade és 50 μg ml-1 DNáz I, HBSS 10 mM HEPES és 30 mM taurin)71 tartalmaztak. A szöveteket ollóval (FST) felaprítottuk, és a melegítővel ellátott gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) segítségével automatikusan emésztettük. A kardiomiocitáktól megfosztott egysejtes szuszpenziót 20% magzati szarvasmarha-szérumot (FBS) tartalmazó alapoldattal (Gibco) mostuk, 70μm-es nejlon szűrőn (BD Falcon) szűrtük, centrifugálással (330g, 10 perc, 4 °C) gyűjtöttük össze és 0,2% FBS-t (Gibco) tartalmazó alapoldatban reszuszpendáltuk. A sejteket minden centrifugálás után háromszor kézzel megszámoltuk Trypan-kék kizárással, és legalább 2 × 106 ml-1 koncentrációban reszuszpendáltuk. Az egyes sejteket a Chromium Controller (10X Genomics) segítségével dolgoztuk fel a gyártó protokollja szerint.

CD45+ sejtek dúsítása

A sejtszuszpenziót a fent leírtak szerint készítettük el, majd anti-humán CD45 monoklonális antitesttel konjugált mikrogyöngyökkel jelöltük a gyártó protokollja szerint (Miltenyi Biotec). Röviden, legfeljebb 107 sejtet inkubáltunk 15 percig 4 °C-on 80 μl PBS, BSA, EDTA pufferben (1× PBS pH 7,2, 0,5% BSA, 2 mM EDTA), amely 20 μl CD45 mikrogyöngyöt tartalmazott. A sejtszuszpenziót egyszer PBS, BSA, EDTA pufferben mostuk, majd centrifugálással (330 g, 10 perc, 4 °C) gyűjtöttük össze. A reszuszpendált sejteket MACS LS oszlopokra (Miltenyi Biotec) vittük fel. A CD45-mentesített sejtfrakciót három PBS, BSA és EDTA pufferrel történő mosás után elvetettük, a CD45+ sejtfrakciót pedig PBS, BSA és EDTA pufferben gyűjtöttük össze az oszlopok mágneses mezőből való eltávolításával. A CD45+ sejteket megszámoltuk és PBS, BSA és EDTA pufferben legalább 2 × 106/ml koncentrációig reszuszpendáltuk, mielőtt a további feldolgozást Chromium Controller (10X Genomics) segítségével a gyártó protokolljának megfelelően végeztük.

Chromium 10X könyvtárkészítés

Az egyes sejteket és sejtmagokat kézzel számoltuk Trypan kék kizárással vagy automatikusan Countess II (Life Technologies) segítségével, legalább két külön számlálással. A sejt- vagy sejtmag-szuszpenziót 400-1000 sejt/mikroliterre állítottuk be, és a Chromium Controllerre (10X Genomics) töltöttük, a célzott sejt- vagy sejtmag-visszanyerés 4 000-10 000 sejt/reakciónként. A 3′ génexpressziós könyvtárakat a v2 vagy v3 Chromium Single Cell Reagent Kits (10X Genomics) gyártójának utasításai szerint készítettük el. A cDNS és a végleges könyvtárak minőségellenőrzése Bioanalyzer High Sensitivity DNA Analysis (Agilent) vagy 4200 TapeStation System (Agilent) segítségével történt. A könyvtárak szekvenálását a Wellcome Sanger Institute-ban a HiSeq 4000 (Illumina), a Harvard Medical Schoolban pedig a NextSeq 500 (Illumina) segítségével végeztük, sejtenként vagy sejtmagonként legalább 20 000-30 000 olvasáspár mélységgel (22. kiegészítő táblázat).

Térbeli validálás smFISH segítségével RNAscope szondákkal

A formalin-fixált, paraffinba ágyazott (FFPE) minták előkészítése során a friss szöveteket 18-36 órán keresztül semleges pufferelt 10%-os formalinban fixáltuk, majd paraffinblokkokba ágyaztuk. A rögzített-fagyasztott szövetmintákat 4%-os paraformaldehidben (ThermoFisher) rögzítettük. A metszeteket 5 μm vastagságban vágtuk mikrotómmal, és SuperFrost Plus tárgylemezekre (VWR) helyeztük. Az FFPE szövetlemezeket automatikusan festettük a BOND RX (Leica) és az RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit v2 Assay (ACDBio) segítségével a gyártó protokollja szerint. A fixált-fagyasztott szövetlemezeket az RNAscope Multiplex Fluorescent Assay v1 (ACDBio) protokollja szerint dolgoztuk fel. Az RNAscope kész vagy egyedi célszondákat párhuzamosan futtattuk a multiplex pozitív és negatív kontrollokkal (bővített adatok 12b. ábra, 23. kiegészítő táblázat). Minden sejtmagot DAPI-vel festettünk. Minden FFPE szövetlemezt Opera Phenix High-Content konfokális szűrőrendszerrel (Perkin Elmer) képeztünk le, 1 μm-es z-lépésmérettel és 20×-os vízimmersziós objektívvel (NA 0,16, 0,299 μm/pixel). Csatornák: DAPI (gerjesztés 375 nm, emisszió 435-480 nm), Atto 425 (gerjesztés 425 nm, emisszió 463-501 nm), opal 520 (gerjesztés 488 nm, emisszió 500-550 nm), opal 570 (gerjesztés 561 nm, emisszió 570-630 nm), opal 650 (gerjesztés 640 nm, emisszió 650-760 nm). A fixált-fagyasztott szövetlemezeket LSM710 konfokális mikroszkóppal (Zeiss) és 40× olaj-immersziós objektívvel (1,3 olaj, DIC III) képeztük le. Csatornák: DAPI (gerjesztés 375 nm, emisszió 435-480 nm), Alexa Fluor 488 (gerjesztés 492 nm, emisszió 517 nm), Atto 550 (gerjesztés 560 nm, emisszió 575 nm) és Atto 647 (gerjesztés 649 nm, emisszió 662 nm). A vizualizálás és a háttér eltávolítása (gördülő gömbsugár) a Fiji/ImageJ72 segítségével történt. A jobb vizualizáció érdekében álszíneket használtunk.

Haematoxilin és eozin festés

A szövetmintákat frissen fagyasztottuk izopentánban (ThermoFisher) -80 °C-on és OCT-be ágyaztuk (VWR). A metszeteket 10 μm vastagságban vágtuk mikrotómmal, SuperFrostPlus tárgylemezekre helyeztük (VWR), majd a standard hematoxilin és eozin festési protokoll szerint dolgoztuk fel (bővített adatok 12a. ábra).

A vázizomszövetek felvétele

A bordaközi izommintákat a bal oldal második és harmadik bordája között vettük. Ez jellemzően az izom legmélyebb (a bőrtől legtávolabbi) rétegéből származik. A mintákat közvetlenül a hideg konzerváló oldatba gyűjtöttük.

Magok izolálása a vázizomzatból

Az izomszövetet 1× PBS-ben mostuk, megtisztítottuk a látható zsírlerakódásoktól, és felaprítottuk, hogy körülbelül 1 mm3 -es darabokat kapjunk. Mintánként körülbelül 0,3 g darált szövetet homogenizáltunk 3 ml A pufferben (250 mM szacharóz, 10 mg ml-1 BSA, 5 mM MgCl2, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasIn, 1× proteáz inhibitor) Dounce szövetdaráló készlet (Merck) segítségével, a laza pisztoly 50 ütésével (A). A homogenizátumot 100 μm-es sejtszűrőn (Corning) szűrtük át, majd a szűrőt 1 ml, majd 750 μl A pufferrel mostuk. A Triton X-100 (0,5%-os végkoncentráció) hozzáadása után az elegyet tovább homogenizáltuk a szoros pisztoly 50 ütésével (B). 40 μm-es szűrőn való szűrés után a sejtmagokat centrifugáltuk (3000 g, 5 perc, 4 °C), 1 ml B pufferben (320 mM szacharóz, 10 mg ml-1 BSA, 3 mM CaCl2, 2 mM magnézium-acetát, 0.1 mM EDTA, 10 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, 1× proteáz inhibitor, 0,12 U μl-1 RNaseIn, 0,06 U μl-1 SUPERasin) és 27%-os Percoll gradiens oldat segítségével tisztítottuk. A Percoll-keveréket 20 000 g-nél centrifugáltuk (15 perc, 4 °C), a pelletet 200 μl B pufferben reszuszpendáltuk, majd centrifugáltuk (20 000 g, 3 perc, 4 °C). Trypan-kék festés után az ép sejtmagokat hemocitométerrel megszámoltuk. A sejtmagokat a gyártó protokollja szerint Chromium Controller (10X Genomics) segítségével profiloztuk.

Egysejtes izolálás a vázizomzathoz

Az izomszövetet 1× PBS-ben mostuk, megtisztítottuk a látható zsírlerakódásoktól és finomra daráltuk. Ezután 2 g darált szövetet az 1. emésztési pufferbe (750 U ml-1 2-es típusú kollagenáz 1× PBS-ben) helyeztünk át, és 37 °C-on vízfürdőben 90 percig inkubáltuk. A részben emésztett szövetet centrifugálással (650 g, 5 perc, 4 °C) összegyűjtöttük, és a pelletet a 2. emésztési pufferben (100 U ml-1 2. típusú kollagenáz, 2 U ml-1 diszpáz PBS-ben) reszuszpendáltuk. Vízfürdőben 37 °C-on történő 30 perces inkubáció után az emésztést 2% FBS hozzáadásával állítottuk le. A sejteket 100 μm-es és 40 μm-es nejlon szűrőn (BD Falcon) keresztül szűrtük, centrifugálással (650 g, 4 °C, 3 perc) gyűjtöttük össze és 1× PBS-szel, 2% FBS-szel mostuk. Ezt követően 20%-os Percoll-gradienst (15 000g, 4 °C, 20 perc) használtunk a sejttisztításhoz. A sejteket tartalmazó réteget összegyűjtöttük, 2% FBS-t tartalmazó PBS-ben mostuk, és az életképes sejteket Trypan-kék kizárással számoltuk meg hemocitométerrel. A sejtmagok profilozását Chromium Controller (10X Genomics) segítségével végeztük a gyártó protokollja szerint.

A módszerek kulcsfontosságú forrásainak táblázata a 24. kiegészítő táblázatban található.

Transcriptome mapping

A szekvenálás után a mintákat demultiplexáltuk és CRAM fájlként tároltuk. Minden mintát a 10X Genomics által biztosított humán referencia genomra (GRCh38 v.3.0.0) térképeztünk le a CellRanger suite (v.3.0.1) segítségével, alapértelmezett paraméterekkel. Az egysejtű mintákat a megadott referencia alapján térképeztük le. Az egymagvú mintákat, a pre-mRNS-referenciát a 10X Genomics utasításai (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/software/pipelines/latest/advanced/references) alapján hoztuk létre.

Count adatok feldolgozása

A feltérképezés után az egyes adatforrásokból (egymagvú, egysejtű és CD45+ sejt) származó mintákat egyedi AnnData objektumokba csoportosítottuk a raw_feature_bc_matrix_h5.h5 konkatenálásával és a megfelelő metaadat információk hozzáadásával. Minden egyes adatforrás-objektum esetében kiszámítottuk az egyedi molekuláris azonosítók (UMI-k) átlagát (n_counts), amelyet az üres cseppek küszöbértékeként használtunk.

Dublettek észlelése

Az üres cseppek eltávolítása után a scrublet73 alkalmazásával minden egyes sejthez egy doublet-pontszámot (scrublet_score) rendeltünk. Ezeket a sejteket az UMAP módszer74 segítségével klasztereztük és vizualizáltuk. Ezenkívül minden egyes sejtet feldolgoztunk a doublet detektáláshoz egy perkolációs módszerrel, amely lehetővé teszi a doubletek jobb detektálását75.

Cellák minőségellenőrzése és szűrése

Minden adatforrást külön dolgoztunk fel és jegyzeteltünk, hogy figyelembe vegyük a forrásspecifikus minőségi különbségeket. Ezek a metrikák kovariátorként szerepelnek a további feldolgozásban. Az összes sejtet és a CD45+ sejteket a számok (500 < n_counts <15 000), a gének (200 < n_genes), a mitokondriális gének (percent_mito <20%), a riboszómális gének (percent_ribo <20%) és a scrublet score (scrublet_score <0,3) szempontjából szűrtük. Az egyes sejtmagokat a számok (500 < n_counts <15 000), gének (300 < n_genes <6 000), mitokondriális gének (percent_mito <5%), riboszómális gének (percent_ribo <5%) és scrublet score (scrublet_score <0,3) szempontjából szűrtük. Ugyanezeket a szűrési küszöbértékeket alkalmaztuk a vázizomzat adatállományára is.

Scanpy toolkit 1.576 in Python v.3.7-et használtuk a downstream elemzések elvégzésére, beleértve a normalizálást (normalize_per_cell: counts_per_cell_after = 10 000), a log-transzformációt (log1p), a változó gének felderítését (highly_variable_genes), a nem kívánt variációs források regresszálását (regress_out: n_counts és percent_mito), az adatjellemzők skálázását (scale: max_value = 10) és a PCA-t (pca: using highly variable genes) a korábban leírtak szerint77.

Sorozatos igazítás mély variációs autoencoderrel

Az adatainkban szereplő összes adatforrás és donor igazításával globális sokaságot építettünk. Ezt egy háromlépéses eljárással végeztük: (1) Minden forrást külön elemeztünk és annotáltunk, és csak a donorok esetében végeztünk igazítást egy pericita-térbeli lineáris regressziós lépés segítségével, mielőtt a bbknn78 segítségével történő kötegelt igazítást elvégeztük. A differenciálisan expresszált géneket (DEG-k) a Scanpy keretrendszerben implementált Wilcoxon rangsorösszeg-teszt segítségével számoltuk ki Bonferroni-Hochberg kiigazítással. (2) Az egyes klaszterek annotálásához integratív megközelítést alkalmaztunk a ToppFun79 és az EnrichR80 adatbázisok alapján a legjelentősebb DEG-k (P < 1 × 10-5) logFC >1 értékkel történő keresésével. Az útvonalakra, transzkripciós szabályozásra és biológiai folyamatokra vonatkozó szignifikáns találatokat rangsoroltuk egy adott klaszter annotálásához. Minden egyes sejtkompartmentet az adata.obs slot alatt jelöltünk meg a forrásspecifikus sejtállapotok csoportosítása után. (3) Az összes forrást egyetlen AnnData objektumban egyesítettük az adata.obs címke alatt. A tételek összehangolása az scGen variációs autoencoder81 batch_correction függvényének használatával történt. Először az adata.obs esetében igazítunk, az adata.obs-t használva horgonyként. Ezután az adata.obs-ra igazítottunk, az adata.obs-t használva horgonyként. Minden egyes kötegelt igazítási kört 50 epochán keresztül futtattunk.

Az adipociták, az érrendszeri és az immunrendszeri szívpopulációk, valamint a csontvázizom-elemzés manifoldjait ezzel a módszerrel hoztuk létre, és a klaszterezési pontosságot az SCCAF82 segítségével értékeltük (Extended Data Fig. 12d).

DEG-k

Az egyes sejtkompartmentek alpopulációinak annotációját segítendő, a DEG-ket a scanpy munkafolyamatban implementált és a legújabb benchmarking tanulmányok által ajánlott Wilcoxon rank sum teszt segítségével számoltuk ki83. Egy gént akkor tekintettünk differenciálisan expresszáltnak, ha log2-transzformált hajtásváltozása > 1 és P < 1 × 10-5 volt, hacsak az elemzési részben másként nem szerepel.

Cellasejt-kölcsönhatások

A vizsgált populációk expressziós mátrixait exportáltuk az AnnData-ból, egy metaadattáblával együtt, amely indexként tartalmazta a sejt-barcódokat. Ezután futtattuk a CellPhoneDB-t a következőképpen: cellphonedb method statistical_analysis meta.tsv counts.tsv-counts-data = gene_name-threads = 60. A CellPhoneDB nyers előrejelzéseit úgy szűrtük, hogy eltávolítottuk azokat a kölcsönhatásokat, amelyek P > 1,0 × 10-5 értékkel rendelkeztek. A szignifikáns párokat ezután génkészlet-gazdagodási elemzésre küldtük be a ReactomeDB-be, az enrichR-be és a ToppFun-ba funkcionális besorolás céljából. Az érrendszeri sejteket az elemzés előtt 39 000 sejtre, a szívjavító csoportot (pitvari és kamrai kardiomiociták, FB-k és immunsejtek) pedig 69 295 sejtre véletlenszerűen almintavételeztük az elemzés előtt.

A génexpresszió vizualizálása a 10X Genomics Visium-adatokon

A 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/spatial-gene-expression/datasets/1.0.0/V1_Human_Heart) nyilvánosan elérhető bal kamrai szívizom Visium-adatait a Scanpy v.1..5 munkafolyamatot használtuk, amelyet a 10X Genomics Visium-adatok elemzéséhez igazítottunk (https://scanpy-tutorials.readthedocs.io/en/latest/spatial/basic-analysis.html). Röviden, az 500-nál kevesebb UMI-t vagy 20 000-nél több UMI-t és 200-nál kevesebb gént tartalmazó foltokat eltávolítottuk. Az adatokat log-transzformáltuk és normalizáltuk az ábrázolás előtt.

RNS sebesség becslése

Az egyes sejtek és a CD45+ dúsított egyes sejtek RNS sebességének kiszámításához a CellRanger kimeneti BAM fájlt és a GENCODE v33 GTF (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_human/release_33/gencode.v33.chr_patch_hapl_scaff.annotation.gtf.gz) fájlt használtuk a velocyto84 CLI v.0.17.17-vel együtt, hogy egy szövőszék fájlt hozzunk létre, amely tartalmazza a splicelt és nem splicelt RNS mennyiségi meghatározását. Ezután egy manifoldot építettünk, klasztereztük a sejteket és az scVelo85 segítségével vizualizáltuk az RNS sebességét.

A pitvari és kamrai kardiomiociták, FB-k és neuronális sejtek alpopulációs elemzése

A globális objektumban kardiomiocitaként, fibroblasztként és neuronális sejtként megjelölt összes vonalkódot kiválasztottuk a további alpopulációs elemzésekhez. További sejtpopuláció-specifikus szűrési kritériumokat alkalmaztunk a sejtmagokra az alábbiak szerint: kardiomiocita szám (n_counts <12 500), gének (n_genes <4 000), mitokondriális gének (percent_mito <1%), riboszómális gének (percent_ribo <1%) és scrublet score (scrublet_score <0.25); FB mitokondriális gének (percent_mito <1%), riboszómális gének (percent_ribo <1%); neuronális sejtgének (n_genes <4000), mitokondriális gének (percent_mito <1%), riboszómális gének (percent_ribo <1%). A pitvari és kamrai kardiomiociták adatkészleteiből kizártuk a teljes és a CD45+ sejteket, és nem járultak hozzá a szubpopulációs elemzéshez. Nem alkalmaztunk további szűrést a FB-k vagy a neuronális sejtek összes és CD45+ sejtjei tekintetében. A kardiomiocitákat és FB-ket ezután tovább osztottuk két csoportba a származási régió alapján: (1) bal és jobb pitvar, valamint (2) bal és jobb kamra, apex és interventrikuláris septum.

A donorhatásokat a fenti (1) lépésben leírtak szerint igazítottuk. A FB és a neuronális sejtek esetében a forrásokat a fenti (3) lépésben leírtak szerint igazítottuk. Leiden klaszterezést és UMAP vizualizálást végeztünk az alpopulációk azonosításához és vizualizálásához86. A differenciálisan expresszált géneket a Wilcoxon rangsorösszeg-teszt segítségével számoltuk ki. A géneket pontszám szerint rangsoroltuk.

A szív immunpopulációinak szövetközi összehasonlítása a vázizom, a vese és a vér immunpopulációival

Egysejtes transzkriptom adatokat gyűjtöttünk felnőtt vesékre a ref. 99 (https://www.kidneycellatlas.org/) adataiból, és a tanulmányukban közölt összes immunsejtet alcsoportba soroltuk. Az SKM számára az összevont sokaságból kiválasztottuk az annotált immunsejteket. Az emberi vérhez a 10X Genomics (https://support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression/datasets/3.0.0/pbmc_10k_v3) által biztosított, nyilvánosan elérhető 10 000 egyedi PBMC sejt adathalmazt használtuk. A korábban leírtaknak87 megfelelően logisztikus regressziós modellt képeztünk ki a szív immunsejtjeire az expressziós adatok 80%-ának felhasználásával, és a pontosságát a fennmaradó 20%-on teszteltük, így egy 0,6862-es pontosságú modellt kaptunk (bővített adatok 8f. ábra, 16. kiegészítő táblázat). Ezt követően ezt a modellt alkalmaztuk a felnőtt vesében, az SKM-ben és a PBMC-kben lévő analóg szívimmunpopulációk előrejelzésére. A 0,8-nál kisebb valószínűségű előrejelzéseket kizártuk a későbbi összehasonlító elemzésekből.

Gene ontológiai gazdagodási elemzés

A kamrai kardiomiocita populációhoz a gProfileR (https://cran.r-project.org/web/packages/gProfileR/index.html) R csomagot használtuk, bemenetként a vCM4 pontszámmal rangsorolt génlistáját, háttérként pedig a kamrai kardiomiocitákban kifejeződő gének halmazát (azok a gének, amelyek UMI száma >1). Az érsejtek Gene Ontology-elemzésének elvégzéséhez az 500 legjelentősebb DEG-t (P < 1 × 10-5), amelyek log-transzformált hajtásváltozása > 1 volt, a Gene Ontology biológiai folyamatok adatbázisában kerestük a ToppFun79 segítségével (25. kiegészítő táblázat). Kiválasztottuk és hőtérképen ábrázoltuk a minden alpopulációra vonatkozó öt legjelentősebb szignifikánsan feldúsult kifejezést (q < 0,05). Az útvonal-elemzés elvégzéséhez az adipocitákon a ToppFun79 útvonal-adatbázisok alapján kerestük a legjobb 500 szignifikáns DEG-t (P < 1 × 10-5), amelyek log-transzformált hajtásváltozása > 0,5 volt (26. kiegészítő táblázat). Kiválasztottuk az öt legjelentősebb szignifikánsan feldúsult útvonalat (q < 0,05) minden alpopuláció esetében, és hő térképen ábrázoltuk.

Gene set score

A scanpy-ban implementált score_genes függvényt használtuk az Oncostatin M útvonalban részt vevő gének feldúsulásának kiszámításához. A gének listáját irodalomkutatás88,89 alapján gyűjtöttük össze. A génkészlet-gazdagításhoz csak a magasan expresszált géneket vettük figyelembe a zaj csökkentése érdekében (több mint 500 UMI az összes sejtben). Ugyanezt az elemzést végeztük el a szív immunsejtjeinek összehasonlítására a mi vizsgálatunkban a szív-rezidens makrofágokkal51, az egérszövet-remodellező makrofágokkal45 és a sárgatest-vonalból származó makrofágokkal90 kapcsolatos korábbi tanulmányok megfigyeléseivel.

Statisztikák és reprodukálhatóság

Minden elemzést az R Software, v.3.6.1 segítségével végeztünk. Az egyes helyeken a sejttípus-eloszlások összehasonlítására Student’s t-teszteket alkalmaztunk. A P < 0,05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. A lineáris regressziós modelleket (korrelációkat) az R lineáris modell funkció (lm) segítségével kaptuk, amely megbecsüli a lineáris kapcsolat statisztikai valószínűségét (P-érték). A többszörös teszteléshez Bonferroni korrekciót alkalmaztunk.

Az ábrákon látható RNAscope mikroszkópos felvételek reprezentatívak. A 2g, 3c, h ábrákon és a 3c (HAMP), 3e (CNN1), 4g, m, 6f ábrákon szereplő mikroszkópiákat hasonló eredményekkel megismételtük két egyedi szöveti metszeten. A 2h., 3f. ábrán és a 3c. ábra (CNN1), a 3e. ábra (PCDH7), a 6e., h., 9d. ábra (kibővített adatok) mikroszkópos felvételeit három egyedi szövetszelvényen ismételtük meg hasonló eredményekkel. Az 1e., 2d., 3e. ábrán és az 1f., 3c. ábrán (FHL1) és a 6d. ábrán (bővített adatok) látható mikroszkópos felvételeket négy egyedi szöveti metszeten ismételtük meg hasonló eredményekkel. A 2c. ábrán és a 3c. ábrán (PRELID2), valamint a 10e. és 12a. ábrán (bővített adatok) látható mikrofelvételeket hat vagy több egyedi szövetszelvényen hasonló eredményekkel megismételtük. A pozitív és negatív kontrollokat használt mintákonként egyszer végeztük el.

GWAS gazdagodási elemzés

A GWAS összefoglaló statisztikákat a broad cvdi, EBI GWAS katalógusból és a GWAS atlaszból töltöttük le. Kiválasztottuk azokat a tulajdonságokat, amelyeknél a GWAS jól erősített (n > 5000 és a szignifikáns lókuszok száma >10). A GWAS-adatkészleteket a 27. kiegészítő táblázat foglalja össze. A fehérjekódoló gének génexpressziós adatait Entrez génazonosítókra térképeztük le, és ezeket a génannotációkat a humán genom hg19/37 összeállításán használtuk fel. Csak a sejtmagokból származó génexpressziós adatokat használtuk fel. A korábban leírt elemzést64 pythonban és R-ben implementáltuk. A log-transzformált számlálásokat (plusz egy pszeudocount) használtuk az átlagos sejttípus-specifikus expressziós profilok kiszámításához. Minden egyes sejttípusra egyedi magma-elemzéseket végeztünk, mindig az alapértelmezett génszintű kovariánsokat (például a génhosszúságot) és az összes sejtre vonatkozó átlagos génexpressziót kondicionálva. Ezt követően a Benjamini-Hochberg-módszert alkalmaztuk, és olyan sejttípus-tulajdonsági asszociációkat választottunk ki, amelyek FDR < 10%. Ezeket a párokat ezután a korábban leírt64 feltételes elemzésnek vetettük alá, hogy meghatározzuk a “független”, “közösen magyarázott” és “részben közösen magyarázott” asszociációs párokat (28. kiegészítő táblázat).

A szétszórt sejtek és izolált sejtmagok eloszlása

Az izolált sejtmagok és a szétszórt sejtek kinyerésére szolgáló különböző eljárások a sejttípusok jelentősen eltérő eloszlását eredményezték (29. kiegészítő táblázat, 2. bővített adatok ábra). Nevezetesen, az izolált sejtmagok 30,1%-a és 49,2%-a pitvari és kamrai kardiomiocitákból származott a pitvari és kamrai régiókban, míg az izolált és CD45-szelektált sejtek preparátumaiból ezeket a sejteket többnyire kizárták (Kiegészítő 2. táblázat).

A kardiomiociták kizárásával az izolált sejtmagokból és a diszpergált sejtekből azonosított sejttípusok eloszlása továbbra is eltérő maradt (Kiegészítő 30. táblázat). Bár a diszpergált sejtek 59,0%-a EC volt, a sejtmagoknak csak 15,7%-a származott EC-kből. Ezzel szemben a sejtmagok 64,2%-a FB-okból (31,2%) és pericitákból (33,0%) származott, míg a diszpergált sejteknek csak 17,1%-a volt FB (2,3%) és pericita (14,8%). Ezek a különbségek tükrözhetik az EK-magok érzékenységét az izolációs eljárásokkal szemben, vagy a periciták és FB-k ellenállását a sejtek enzimes emésztésével szemben.

Az izolált sejtmagok és a diszpergált sejtek közötti sejtmegoszlásbeli különbségek ellenére a sejtvonalak génexpressziós profiljai ésszerűen korreláltak (r > 0,4 minden sejttípus esetében). A sejtek és sejtmagok által rögzített gének egyezőségének vizsgálatához összehasonlítottuk az 1c. ábrán látható főbb sejttípus-markerek expresszióját a három forrás között (Extended Data 1c. ábra). Mivel a sejtmagokból hiányzik a citoplazmatikus RNS, bizonyos gének, különösen az NKG7 és a C1QA immungének expressziója alacsonyabb volt a sejtmagokban, mint a sejtekben. Mindazonáltal a markergénekkel kapcsolatos általános tendencia a három forrásban egységes volt, és ugyanazok a gének különböztették meg az egyes sejttípusokat a forrástól függetlenül.

A vaszkuláris sejtek további elemzése

A PC3_str a sejtek és a sejtmagok hasonló hozzájárulását tartalmazta, és a scrublet-pontszám az alkalmazott szigorú küszöbérték alatt volt; ennek ellenére a gének átlagos száma és száma ebben a klaszterben magasabb volt az átlagosnál. Így a szigorú minőségszűrésünk ellenére sem zárhatjuk ki, hogy ebben a klaszterben előfordulhatnak kettősök. Az EC10_CMC-like és a PC4_CMC-like EC vagy pericita géneket koexprimál kardiomiocita markerekkel, és további vizsgálatok szükségesek annak megértéséhez, hogy ezek korábban ismeretlen sejtállapotokat vagy doubleteket képviselnek-e.

Az artériás és vénás SMC-re vonatkozó megfigyeléseket alátámasztják a korábbi tanulmányok, amelyek azt jósolják, hogy az artériás SMC-k kontraktilisabbak, a vénás SMC-k pedig kevésbé differenciáltak91.

Az EC3_cap az AP1 komponenseit (JUN és FOS) kódoló transzkripteket gazdagítja, amely számos EC-sorsdöntést közvetít, beleértve a VEGF-re, gyulladásos és stresszjelekre adott választ, valamint az ATF3-at, egy adaptív válaszgént, amelyet különböző jelek indukálnak92,93,94.

Vázizom jellemzése

Öt egészséges egyéntől, köztük egy donortól megfelelő szívszövetet tartalmazó interkosztális vázizom mintákat gyűjtöttünk, és 35 665 egyedi sejt és 39 597 egyedi sejtmag transzkriptomját profiloztuk. A szívhez hasonlóan a sejtek és sejtmagok kombinációja lehetővé tette számunkra a főbb sejtvonalak, köztük a kardiomiociták, fibroblasztok, endotélsejtek, simaizomsejtek, periciták, myeloid és lymphoid immunsejtek és szatellit sejtek rögzítését és felbontását (Extended Data 11a, b ábra, Supplementary Table 31).

A vázizomzat érsejtjeinek további elemzése tíz különböző populációt azonosított. Az endotélsejtek öt klasztert mutattak, amelyek a megfelelő érágyak alapján elkülönültek, a szívben megfigyeltekhez hasonló szignatúrával. Az EC_cap kifejezi a VWF-et és az RGCC-t. A vénás EC_ven ACKR1-et és PLVAP-ot expresszál, míg az artériás EC_art SEMA3G-t és HEY1-et mutat, összhangban a szívadatainkkal (Extended Data 11c, d ábra, 32. kiegészítő táblázat).

A vázizomzat és a szívizomzat ér- és strómaszöveti sejtpopulációinak általános eloszlása hasonló volt, beleértve az EC-k artériás és vénás jellemzőit is; azonban; a vázizomzat egyetlen SMC-klasztert tartalmazott, ami valószínűleg az adatállomány kisebb méretével függ össze. A vázizomzatban az EC_art és az SMC-k prediktált sejt-sejt kölcsönhatásai között szerepelt a NOTCH1/4-JAG1, valamint a JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH3, de nem a szívben levezetett JAG1/JAG2/DLL4-NOTCH2 (Extended Data 11e, f ábra, 33. kiegészítő táblázat).

A szív immunsejtjei

A logisztikus regressziós modell segítségével nem azonosítottuk a szív IL17RA+ monocitáinak megfelelőjét az SKM-ben vagy a vesében, valószínűleg e populáció kis mérete miatt.

Az azonosított naiv T-sejtek (CD4+T_naive) CCR7-et és SELL-t expresszáltak, ami naiv és szövetrezidens jellegükre utal95. A memória T-sejtek (CD8+T_tem) BACH2-t, STAT4-et és IL7R-t expresszáltak, ami a hosszú távú immunmemóriához kapcsolódik96,97. A nyiroksejteket scNym98 segítségével tovább jellemeztük, és publikált adatok99,100 alapján képeztük ki. Az így kapott modellt alkalmaztuk a szív immunsejtjeinkre, és azokat a sejteket, amelyek előrejelzett pontszáma magasabb volt, mint 0,8, valószínűleg jelölteknek tekintettük az újraannotálásra. Ezzel a megközelítéssel jelölteket azonosítottunk a plazma B-sejtek (109), dendritikus sejtek (645), veleszületett limfoid sejtek (89), MAIT T-sejtek (219), T helper sejtek (80) T szabályozó sejtek (11), T központi memória sejtek (103), γδ T-sejtek (30) és plazmocitoid dendritikus sejtek (27) számára. Ezek az annotációk megtalálhatók a szív-immun objektum annotációkban az “scNym” címke alatt a www.heartcellatlas.org oldalon.

Reporting summary

A kutatás tervezéséről további információ a Nature Research Reporting Summary-ban található, amely ehhez a cikkhez kapcsolódik.