RuBisCO

RuBisCO on yksi monista Calvinin syklin entsyymeistä. Kun Rubisco helpottaa CO2:n hyökkäystä RuBP:n C2-hiileen ja sitä seuraavaa C3- ja C2-hiilen välisen sidoksen pilkkoutumista, muodostuu 2 molekyyliä glyseraatti-3-fosfaattia. Konversio sisältää seuraavat vaiheet: enolisaatio, karboksylaatio, hydrataatio, C-C-sidoksen pilkkoutuminen ja protonoituminen.

SubstraatitEdit

RuBisCO:n substraatit ovat ribuloosi-1,5-bisfosfaatti ja hiilidioksidi (erotuksena ”aktivoivasta” hiilidioksidista). RuBisCO katalysoi myös ribuloosi-1,5-bisfosfaatin ja molekulaarisen hapen (O
2) reaktiota hiilidioksidin (CO
2) sijasta.Substraattien CO2 ja O2 erottaminen toisistaan johtuu substraatin kvadrupolimomenttien erilaisista vuorovaikutuksista ja suuresta sähköstaattisen kentän gradientista. Tämä gradientti muodostuu minimaalisesti aktiivisen RuBisCO:n dimeerimuodosta, joka tarjoaa kahden komponenttinsa kanssa vastakkaisesti varautuneiden domeenien yhdistelmän, jota tarvitaan entsyymin vuorovaikutuksessa O2:n ja CO
2:n kanssa. Nämä olosuhteet auttavat selittämään RuBisCO:lla havaitun alhaisen liikevaihtonopeuden: jotta voidaan lisätä sähkökentän voimakkuutta, jota tarvitaan riittävään vuorovaikutukseen substraattien kvadrupolimomenttien kanssa, entsyymin C- ja N-pääteiset segmentit on suljettava, jolloin aktiivinen keskus voidaan eristää liuottimesta ja dielektrisyysvakio laskee. Tällä eristämisellä on merkittävä entrooppinen kustannus, ja se johtaa huonoon liikevaihtonopeuteen.

Sitoutuminen RuBPEdit

Lys201:n ε-aminoryhmän karbamylaatiota vakauttaa koordinaatio Mg2+:n kanssa. Tähän reaktioon liittyy Asp203:n ja Glu204:n karboksylaattiterminaalien sitoutuminen Mg2+-ioniin. Substraatti RuBP sitoutuu Mg2+:aan syrjäyttäen kaksi kolmesta akvaligandista.

EnolisaatioEdit

RuBP:n enolisaatio on RuBP:n keto-tautomeerin muuttamista enedioli(ate)ksi. Enolisaatio käynnistyy C3:n deprotonoinnilla. Entsyymin emäksestä tässä vaiheessa on kiistelty, mutta kiderakenteissa havaittujen steeristen rajoitusten vuoksi Lys201 on todennäköisin ehdokas. Erityisesti Lys201:n karbamaattihappi, joka ei ole koordinoitunut Mg-ionin kanssa, deprotonoi RuBP:n C3-hiilen muodostaen 2,3-enediolaatin.

KarboksylaatioEdit

Karboksylaatio 2,3-enediolaatista johtaa välituotteeseen 3-keto-2′-karboksiarabinitoli-1,5-bisfosfaatti, ja Lys334 on sijoitettu helpottamaan hiilidioksidisubstraatin additiota, koska se korvaa kolmannen Mg2+-koordinoidun vesimolekyylin, ja se voi liittyä suoraan enedioliin. Tässä prosessissa ei muodostu Michaelis-kompleksia. Tämän ketonin hydrataatio johtaa ylimääräiseen hydroksiryhmään C3:ssa, jolloin muodostuu gem-dioli-väliaine. Karboksylaatiota ja hydrataatiota on ehdotettu joko yhdeksi koordinoiduksi vaiheeksi tai kahdeksi peräkkäiseksi vaiheeksi. Yhteensovitettua mekanismia tukee vesimolekyylin läheisyys RuBP:n C3:een useissa kiderakenteissa. Pinaattirakenteessa muut jäännökset ovat hyvissä asemissa auttamaan hydrataatiovaiheessa, koska ne ovat vetysidontaetäisyydellä vesimolekyylistä.

C-C-sidoksen pilkkoutuminen Muokkaa

Gem-dioli-väliaine pilkkoutuu C2-C3-sidoksessa muodostaen yhden molekyylin glyseraatti-3-fosfaattia ja negatiivisesti varautuneen karboksylaatin. Tämän karbanionin C2:n stereospesifinen protonointi johtaa toiseen molekyyliin glyseraatti-3-fosfaattia. Tämän vaiheen uskotaan helpottuvan Lys175:n tai mahdollisesti karbamyloidun Lys201:n avulla.

TuotteetEdit

Kun substraattina on hiilidioksidi, karboksylaasireaktion tuotteena on epästabiili kuuden hiilen fosforyloima välituote, joka tunnetaan nimellä 3-keto-2-karboksiarabinitoli-1,5-bisfosfaatti ja joka hajoaa nopeasti kahdeksi molekyyliksi glyseraatti-3-fosfaattia. 3-fosfoglyseraatista voidaan valmistaa suurempia molekyylejä, kuten glukoosia.

Rubiscon sivutoiminnot voivat johtaa käyttökelvottomiin tai inhiboiviin sivutuotteisiin; yksi tällainen tuote on ksyluloosa-1,5-bisfosfaatti, joka inhiboi Rubiscon aktiivisuutta.

Kun molekyylinen happi on substraattina, oksygenaasireaktion tuotteina syntyy fosfoglykolaattia ja 3-fosfoglyseraattia. Fosfoglykolaatti kierrätetään fotorespiraatioksi kutsutun reaktiosarjan kautta, johon osallistuu mitokondrioissa ja peroksisomeissa sijaitsevia entsyymejä ja sytokromeja (kyseessä on metaboliittien korjaus). Tässä prosessissa kaksi molekyyliä fosfoglykolaattia muunnetaan yhdeksi molekyyliksi hiilidioksidia ja yhdeksi molekyyliksi 3-fosfoglyseraattia, joka voi palata Calvinin sykliin. Kasvit voivat pidättää osan tähän reittiin tulevasta fosfoglykolaatista tuottaakseen muita molekyylejä, kuten glysiiniä. Ympäristön hiilidioksidi- ja happipitoisuuksissa reaktioiden suhde on noin 4:1, jolloin hiilidioksidin nettosidonta on vain 3,5. Tämän vuoksi hiilidioksidin nettosidonta on vain 3,5. Näin ollen entsyymin kyvyttömyys estää reaktio hapen kanssa vähentää huomattavasti monien kasvien fotosynteesikapasiteettia. Jotkin kasvit, monet levät ja fotosynteettiset bakteerit ovat voittaneet tämän rajoituksen keksimällä keinoja lisätä hiilidioksidipitoisuutta entsyymin ympärillä, kuten C4-hiilensidonta, raakahappoaineenvaihdunta ja pyrenoidin käyttö.

Entsyymitoiminnan nopeusEdit

Jotkut entsyymit kykenevät suorittamaan tuhansia kemiallisia reaktioita sekunnissa. RuBisCO on kuitenkin hidas, sillä se sitoo vain 3-10 hiilidioksidimolekyyliä sekunnissa entsyymimolekyyliä kohti. RuBisCO:n katalysoima reaktio on siis Calvinin syklin ensisijainen nopeutta rajoittava tekijä päivän aikana. Useimmissa olosuhteissa ja silloin, kun valo ei muuten rajoita fotosynteesiä, RuBisCO:n nopeus reagoi kuitenkin positiivisesti hiilidioksidipitoisuuden kasvuun.

RuBisCO on yleensä aktiivinen vain päivällä, koska ribuloosi-1,5-bisfosfaatti ei uusiudu pimeällä. Tämä johtuu useiden muiden Calvinin syklin entsyymien säätelystä. Lisäksi RuBisCO:n toimintaa koordinoidaan muiden Calvinin syklin entsyymien kanssa useilla muillakin tavoilla:

Ionien toimesta Muokkaa

Kloroplasteja valaistessa strooman pH nousee 7,0:sta 8,0:aan, koska tylakoidikalvon poikki syntyy protonigradientti (vetyioni, H+
). Valo ohjaa protonien liikkumista tylakoideihin, ja se on perustavanlaatuinen kloroplastien ATP-synteesin kannalta (Lisätietoa: Fotosynteesin reaktiokeskus; Valosta riippuvaiset reaktiot). Ionipotentiaalin tasapainottamiseksi kalvon yli magnesiumionit (Mg2+
) siirtyvät vasteena ulos tylakoideista, mikä lisää magnesiumin pitoisuutta kloroplastien stroomassa. RuBisCO:lla on korkea optimaalinen pH (voi olla >9,0 magnesiumionikonsentraatiosta riippuen), ja näin ollen se ”aktivoituu”, kun hiilidioksidia ja magnesiumia tuodaan aktiivisiin kohtiin edellä kuvatulla tavalla.

RuBisCO-aktivaasillaEdit

Kasveissa ja joissakin levissä tarvitaan toista entsyymiä, RuBisCO-aktivaasia (Rca, GO:0046863, P10896), jotta kriittinen karbamaatti muodostuisi nopeasti RuBisCO:n aktiiviseen kohtaan. Tämä on tarpeen, koska ribuloosi-1,5-bisfosfaatti (RuBP) sitoutuu voimakkaammin RuBisCO:n aktiivisiin alueisiin, kun ylimääräistä karbamaattia on läsnä, mikä estää prosessien etenemisen. Valossa RuBisCO-aktivaasi edistää estävän (tai joidenkin näkemysten mukaan varastoivan) RuBP:n vapautumista RuBisCO:n katalyyttisistä kohdista. Aktivaasia tarvitaan myös joissakin kasveissa (esim. tupakka ja monet pavut), koska pimeässä RuBisCO:ta inhiboi (tai suojaa hydrolyysiltä) näiden kasvien syntetisoima kilpaileva inhibiittori, substraattianalogi 2-karboksi-D-arabitinoli-1-fosfaatti (CA1P). CA1P sitoutuu tiukasti karbamyloidun RuBisCO:n aktiiviseen kohtaan ja estää katalyyttisen aktiivisuuden vielä suuremmassa määrin. CA1P:n on myös osoitettu pitävän RuBisCO:n proteolyysiltä suojatussa konformaatiossa. Valossa RuBisCO-aktivaasi edistää myös CA1P:n vapautumista katalyyttisistä kohdista. Kun CA1P on vapautunut RuBisCO:sta, valon aktivoima CA1P-fosfataasi muuttaa sen nopeasti ei-inhiboivaan muotoon. Jopa ilman näitä voimakkaita inhibiittoreita kerran muutamassa sadassa reaktiossa normaalit reaktiot hiilidioksidin tai hapen kanssa jäävät kesken; aktiiviseen kohtaan muodostuu edelleen muita inhiboivia substraattianalogeja. Jälleen kerran RuBisCO-aktivaasi voi edistää näiden analogien vapautumista katalyyttisistä kohdista ja pitää entsyymin katalyyttisesti aktiivisessa muodossa. Korkeissa lämpötiloissa RuBisCO-aktivaasi kuitenkin aggregoituu eikä voi enää aktivoida RuBisCO:ta. Tämä vaikuttaa osaltaan lämpöstressin aikana havaittuun vähentyneeseen karboksylointikapasiteettiin.

ATP:n/ADP:n ja strooman pelkistymis-/hapettumistilan kautta aktivaasiEdit

Aktivaasin suorittama inhiboivan RuBP:n, CA1P:n ja muiden inhiboivien substraattianalogien poistaminen edellyttää ATP:n kulutusta. Tämä reaktio estyy ADP:n läsnäollessa, ja näin ollen aktivaasiaktiivisuus riippuu näiden yhdisteiden suhteesta kloroplastin stroomassa. Lisäksi useimmissa kasveissa aktivaasin herkkyyttä ATP:n ja ADP:n suhteelle muuttaa stroomassa oleva pelkistys/hapettumistila (redox) toisen pienen säätelijäproteiinin, tioredoksiinin, kautta. Tällä tavoin aktivaasin aktiivisuutta ja RuBisCO:n aktivaatiotilaa voidaan muokata valon intensiteetin mukaan ja siten ribuloosi-1,5-bisfosfaatti-substraatin muodostumisnopeutta.

FosfaatillaEdit

Syanobakteereissa myös epäorgaaninen fosfaatti (Pi) osallistuu fotosynteesin koordinoituun säätelyyn: Pi sitoutuu RuBisCO:n aktiiviseen paikkaan ja toiseen paikkaan suuressa ketjussa, jossa se voi vaikuttaa siirtymiin entsyymin aktivoituneen ja vähemmän aktiivisen konformaation välillä. Tällä tavoin bakteerien RuBisCO:n aktivaatio saattaa olla erityisen herkkä Pi-pitoisuuksille, mikä saattaa saada sen toimimaan samalla tavalla kuin RuBisCO-aktivaasi toimii korkeammissa kasveissa.

Hiilidioksidin avullaEdit

Koska hiilidioksidi ja happi kilpailevat RuBisCO:n aktiivisesta kohdasta, hiilen sidontaa RuBisCO:n avulla voidaan tehostaa nostamalla hiilidioksidipitoisuutta RuBisCO:n sisältävässä lokerossa (kloroplastin stroomassa). Kasvien evoluution aikana on useita kertoja kehittynyt mekanismeja, joilla hiilidioksidipitoisuutta stroomassa voidaan nostaa (ks. C4-hiilen sidonta). Hapen käyttö substraattina vaikuttaa hämmentävältä prosessilta, koska se näyttää heittävän pois talteenotettua energiaa. Se voi kuitenkin olla mekanismi, jolla estetään hiilihydraattien ylikuormittuminen suuren valovirran aikana. Tämä entsyymin heikkous on syynä fotorespiraatioon, jolloin terveiden lehtien nettohiilen sidonta kirkkaassa valossa voi olla nolla, kun RuBisCO:n käytettävissä olevan O
2:n ja CO
2:n suhde siirtyy liian paljon hapen suuntaan. Tämä ilmiö on ensisijaisesti lämpötilariippuvainen: Korkeat lämpötilat voivat pienentää lehtikudosten kosteuteen liuenneen CO
2:n pitoisuutta. Tämä ilmiö liittyy myös vesistressiin: Koska kasvien lehdet jäähtyvät haihtumalla, veden niukkuus aiheuttaa korkeita lehtien lämpötiloja. C4-kasvit käyttävät aluksi entsyymiä PEP-karboksylaasi, jolla on suurempi affiniteetti CO
2:een. Prosessissa syntyy ensin 4-hiilinen väliyhdiste, joka kuljetetaan C3-fotosynteesin paikkaan, josta se sitten dekarboksyloituu, jolloin CO
2 vapautuu ja CO
2-pitoisuus nousee, mistä nimi C4-kasvit.

Kasvit, joilla on hiilihappoaineenvaihdunta (CAM-kasvit), pitävät stomata-aukkonsa suljettuina päivällä, mikä säästää vettä, mutta estää valosta riippumattomien reaktioiden (eli Calvinin syklin) tapahtumisen, koska nämä reaktiot edellyttävät CO
2:n kulkeutumista kaasunvaihdon kautta näiden aukkojen kautta. Lehden yläpuolen kautta tapahtuvaa haihtumista estää vahakerros.

Vahakerros estää haihtumisen lehden yläpuolelta.