Pellegrino esiintyi The X-Filesin 7. kauden 3. jaksossa marraskuussa 1999. Vuonna 2001 hän näytteli David Lynchin kriitikoiden ylistämässä Mulholland Drivessa epäpätevää palkkamurhaajaa.Pellegrino näytteli Showtimen Dexterissä Ritan pahoinpitelevää ex-rikollista entistä aviomiestä Paulia ja myöhemmin Supernaturalissa Luciferia sekä ABC:n Lostissa salaperäistä lähes kuolematonta Jacobia. Hän on esiintynyt televisiosarjoissa Northern Exposure, ER, Without a Trace, NYPD Blue, CSI: Crime Scene Investigation ja Knight Rider.
Hän näytteli ”blondia roistoa”, joka tunki The Duden pään vessanpönttöön ja pudotti keilapallon rikkoen lattialaatan kulttimainetta nauttivassa elokuvassa The Big Lebowski. Hän esiintyi National Treasure -elokuvassa agentti Johnsonina tunnettuna FBI:n tausta-agenttina. Vuonna 2005 Pellegrino esiintyi Oscar-palkitussa elokuvassa Capote näyttelemällä murhaaja Dick Hickockia.
Lukuisten kaapeli- ja verkko-tv-ohjelmarooliensa ohella hän näytteli terroristipommittaja Bobby Jamesia The Beast -sarjassa.
Maaliskuussa 2009 Pellegrino valittiin ABC:n Lost-sarjaan esiintymään viidennen kauden viimeisessä jaksossa salaperäisen Jacobin rooliin. Vaikka jakson lehdistötiedotteessa viitataan hänen hahmoonsa yksinkertaisesti nimellä ”Man No. 1”, jakso paljasti, että Pellegrino esitti Jacobia, salaperäistä hahmoa, joka on keskeinen sarjan juonen kannalta.
Kesäkuun 26. päivänä 2009 ilmoitettiin myös, että Pellegrino oli valettu toistuvaan rooliin Luciferin roolissa CW:n Supernatural-sarjan viidennellä kaudella. Hänellä oli toistuva rooli seitsemännellä kaudella ja päärooli 12. ja 13. kaudella. Hänellä oli päärooli 14. kaudella Nickinä, Luciferin astiana, ja hän oli erikoisvieraana 15. kaudella.
Hän esitti vampyyri ”Bishopia” SyFy:n kauhuohjelmasarjassa Being Human ensimmäisellä kausikaudella, ja hän esittää roolinsa uudestaan myös kakkos- ja kolmoskaudilla sekä takaumina että hallusinaatioina.
Vuonna 2015 Pellegrino liittyi ABC:n trillerisarjaan Quantico näyttelemällä FBI:n apulaisjohtajan Clayton Haasin toistuvaa roolia.
Pellegrino esiintyi myös ääninäyttelijänä vuoden 2018 hittipelissä Far Cry 5:ssä Jacob Seedinä, joka on yksi pelin antagonisteista, mikä oli hänen ensimmäinen roolinsa videopelissä.
Pellegrino näytteli myös ääninäyttelijänä Far Cry 5:ssä.