Kaksi vuotta sitten immunologi ja lääketieteen kustannusalan yrittäjä Leslie Norins tarjoutui myöntämään miljoona dollaria omia rahojaan sellaiselle tutkijalle, joka pystyisi todistamaan, että Alzheimerin tauti johtuu jostakin bakteerista.
Teoria siitä, että infektio voisi aiheuttaa tämän dementian muodon, on jyrissyt vuosikymmenien ajan neurotieteellisen tutkimuksen marginaalissa. Suurin osa Alzheimer-tutkijoista, joita tukee valtava määrä todisteita, ajattelee sen sijaan, että keskeisiä syyllisiä ovat aivoissa olevat tahmeat molekyylit nimeltä amyloidit, jotka kasaantuvat plakeiksi ja aiheuttavat tulehduksen tappaen neuroneja.
Norins halusi palkita työstä, joka tekisi infektioideasta vakuuttavamman. Amyloidihypoteesista on tullut ”perinteisen viisauden vakiintuneen kirkon ainoa hyväksyttävä ja kannatettava uskomus”, Norins sanoo. ”Niitä harvoja pioneereja, jotka tutkivat mikrobeja ja julkaisivat artikkeleita, pilkattiin tai jätettiin huomiotta.”
Suurelta osin tämä johtui siitä, että jotkut varhaiset infektioteorian kannattajat näkivät sen korvaavan amyloidihypoteesin. Mutta jotkut viimeaikaiset tutkimukset ovat antaneet kiehtovia viitteitä siitä, että nämä kaksi ajatusta voisivat sopia yhteen – että infektio voisi kylvää joitain Alzheimerin tautitapauksia käynnistämällä amyloidihyytymien tuotannon.
Tiedot viittaavat amyloidin radikaaliin rooliin neuroneissa. Sen sijaan, että amyloidi olisi vain myrkyllinen jätetuote, sillä saattaa olla oma tärkeä tehtävänsä: se voi auttaa suojaamaan aivoja infektioilta. Mutta ikä tai perimä voi keskeyttää järjestelmän tarkastukset ja tasapainot, jolloin amyloidi muuttuu puolustajasta roistoksi.
Ja tämä ajatus viittaa uusiin mahdollisiin hoitokeinoihin. Testatakseen teoriaa tarkemmin tutkijat kehittävät nyt eläinmalleja, jotka jäljittelevät Alzheimerin tautia tarkemmin. ”Otamme ajatukset vakavasti”, sanoo neurotieteilijä Bart de Strooper, University College Londonissa toimivan UK Dementia Research Instituten johtaja.
Choked by clumps
Amyloidihypoteesin mukaan Alzheimerin tauti johtuu tahmeiden, liukoisten valkuaisaineiden – amyloidi-β-peptidien – kerääntymisestä aivosolujen välisiin tiloihin. Nämä peptidit pilkkoutuvat toisesta proteiinista, joka on upotettu neuronien kalvoihin. Vapaana leijuessaan ne kasaantuvat suuremmiksi rakenteiksi, jotka, jos erityiset entsyymit eivät puhdista niitä riittävän tehokkaasti, kasautuvat plakeiksi. Silloin plakit käynnistävät tappavan kaskadin: ne aiheuttavat neuroinflammaatiota ja synnyttävät nipun jänteviä proteiineja, joita kutsutaan tau-kudoksiksi. Tämän loukkausten litanian edessä neuronit kuolevat.
Hypoteesin kriitikot huomauttavat, että monien sellaisten ihmisten aivoissa, joilla ei ollut Alzheimerin tautia, on kuoleman jälkeen havaittu plakkeja. Ja he viittaavat siihen, että monet kliiniset hoitokokeet, joiden tarkoituksena oli liuottaa amyloidiplakkeja, ovat epäonnistuneet, eikä mikään niistä ole hidastanut taudin etenemistä. Amyloiditeoriaa kannattavat tutkijat väittävät, että vaikka plakkien tiheys vaihtelee paljon yksilöiden välillä, niiden laukaisemien tau-solukkojen tiheys korreloi tiukasti taudin vaikeusasteen kanssa. Heidän mukaansa kliiniset kokeet epäonnistuivat todennäköisesti siksi, että hoitoja annettiin liian myöhään taudin kulussa.
Heillä on myös vahvaa näyttöä puolellaan. On olemassa tiettyjä harvinaisia ja aggressiivisia Alzheimerin taudin muotoja, jotka puhkeavat varhain – 30-60 ikävuoden välillä – ja esiintyvät suvussa; nämä tilat johtuvat mutaatioista geeneissä, jotka säätelevät amyloidin muodostusprosessia ja tulehdusta aivoissa. Lukuisat muut geenit on yhdistetty tavallisemman myöhäisen tautimuodon riskiin. Useat koodaavat proteiineja, jotka muodostavat amyloidikaskadin osia, ja jotkut osallistuvat synnynnäiseen immuunijärjestelmään – ryhmään mekanismeja, jotka aktivoituvat nopeasti estääkseen taudinaiheuttajien leviämisen elimistössä ja jotka aiheuttavat tulehdusta.
Tulehduksen aiheuttajat
Tutkijat, jotka toivovat voivansa testata infektiohypoteesia, ovat lähteneet metsästämään mikrobeja tuhansista kuolemanjälkeisistä Alzheimerin tautia sairastavien ihmisten aivoista. Monista he ovat löytäneet niitä. ”Mutta nämä tutkimukset osoittavat vain korrelaatioita, joilla voi olla selityksiä, joilla ei ole mitään tekemistä mekanismien kanssa”, sanoo de Strooper.
Ruth Itzhaki, brittiläisen Manchesterin yliopiston biofyysikko, joka raportoi havainnoista herpes simplex -virus 1:stä (HSV1) kuolemanjälkeisissä Alzheimerin taudin aivoissa 1990-luvulla1, torjui tällaisen kritiikin. Hänen mielestään mikrobien esiintymisen aivoissa on osoitettava, että niillä on jokin tehtävä, ja hänen ja muiden mielestä heillä on hyviä todisteita siitä, että virukset ovat Alzheimerin taudin keskeinen tekijä. ”Useimmat meistä ovat aina myöntäneet, että amyloidi on hyvin tärkeä Alzheimerin taudin piirre – mutta se ei vain ole syy”, hän sanoo.
Aivokudosnäytteissä, jotka on otettu Alzheimerin tautia sairastavilta ihmisiltä, on joskus mikrobeja.Credit: Patrice Latron/Look at Sciences/SPL
Monia mikrobeja on ehdotettu Alzheimerin taudin laukaisijoiksi, mukaan lukien kolme ihmisen herpesvirusta ja kolme bakteeria: Chlamydia pneumoniae, joka aiheuttaa keuhkoinfektioita; Borrelia burgdorferi, Lymen taudin aiheuttaja; ja viimeisimpänä Porphyromonas gingivalis, joka johtaa iensairauksiin. Teoriassa millä tahansa tartunnanaiheuttajalla, joka voi tunkeutua aivoihin, voisi olla tämä laukaiseva rooli (ei kuitenkaan ole hyviä todisteita siitä, että SARS-CoV-2:lla, COVID-19:n taustalla olevalla viruksella, olisi tämä kyky).
Useimmilla tämän alan ryhmillä on suosikkimikrobi, ja kahdessa vuonna 2018 ilmestyneessä huomiota herättäneessä artikkelissa tutkittiin herpesvirusten roolia. Toinen, Joel Dudleyn ryhmästä Icahn School of Medicine at Mount Sinaissa New Yorkissa, analysoi valtavia eriä geenejä, proteiineja ja kudosrakennetta koskevia tietoja, jotka on tuotettu lähes tuhannesta post mortem -aivosta, jotka ovat saatavilla eri tietokannoista. Ryhmä etsi aivokudoksesta viruksista kertovia merkkejä – herpekselle ominaisia geenipätkiä tai proteiineja – ja totesi, että ihmisen herpesvirus 6A:n (HHV-6A) ja ihmisen herpesvirus 7:n pitoisuudet olivat korkeammat Alzheimerin tautia sairastavilla kuin kontrolleilla2.
Mutta muut tutkijat, mukaan lukien virologi Steven Jacobson National Institute of Neurological Disorders and Stroke -instituutista Bethesdassa, Marylandissa, jonka tutkimusryhmä tutki yli tuhannen kuolemanjälkeisen aivon otosta, eivät onnistuneet toistamaan Dudleyn havaintoa3.
Ja huolimatta Dudleyn tutkimuksen vaikuttavasta yksittäisten aivojen määrästä, tulokset ovat korrelatiivisia. Myös tietojen lähde on huolestuttava, sanoo Michael Heneka Saksan neurodegeneratiivisten sairauksien keskuksesta Bonnissa. Alzheimerin tautia sairastavien aivot ovat huonossa kunnossa ennen kuolemaa, ja kudos hajoaa entisestään ennen ruumiinavausta; mikrobit voivat helposti vuotaa niihin viimeisinä elinpäivinä tai kuoleman jälkeen. ”Emme voi tehdä liikaa oletuksia kuolemanjälkeisen materiaalin perusteella sellaisen taudin patogeneesistä, jonka kehityskaari kestää noin kolme vuosikymmentä”, hän sanoo.
Dudleyn artikkeli ilmestyi kymmenen vuotta kestäneen taiwanilaisen tutkimuksen jälkeen, jossa seurattiin yli 8 000:aa ihmistä, joilla oli diagnosoitu herpes simplex -virus, ja verrattiin heitä 25 000:een 25 000:n hengen kontrolliryhmään, jotka eivät olleet saaneet samaa diagnoosia. Herpestä sairastavien ryhmässä oli 2,5-kertainen riski sairastua Alzheimerin tautiin, mutta tämä lisäys lähes poistui niillä, jotka saivat aggressiivista lääkehoitoa4.
Jopa ennen teorian viimeaikaista nousua, ajatus siitä, että infektiot saattaisivat jollakin tavalla provosoida Alzheimerin tautia, oli saanut sen verran jalansijaa, että tutkijat käynnistivät kliinisen tutkimuksen. Vuonna 2017 New Yorkissa sijaitsevan Columbian yliopiston työryhmä alkoi testata, voisiko viruslääke valasikloviiri hidastaa kognitiivista heikkenemistä ja amyloidiplakkien muodostumista lievää Alzheimerin tautia sairastavilla henkilöillä, joiden testit olivat olleet positiivisia myös herpes simplex -viruksen vasta-aineille. Tuloksia odotetaan vuonna 2022.
Todistustaakka
Kun ihmistutkimukset tuottavat vain korrelaatiota, tutkijat kääntyvät usein eläinkokeiden puoleen etsiessään syytä. Alzheimerin taudin eläinmallit eivät kuitenkaan ole täydellisiä; esimerkiksi hiiret eivät ikääntyessään kehitä tunnusomaisia plakkeja, ellei niitä ole geneettisesti muokattu tuottamaan niitä. Laajalti käytetty 5xFAD-siirtogeeninen hiiri ilmentää viittä merkityksellistä mutaatiota geeneissä, jotka koodaavat pre-amyloidiproteiinia ja yhtä entsyymiä, joka pilkkoo sen amyloidi-β:ksi. Nämä hiiret ilmentävät geenejä erittäin korkealla tasolla, ja niille alkaa kehittyä plakkeja jo kahden kuukauden ikäisinä.
Neurogenetiikan tutkija Rudolph Tanzi ja hänen kollegansa Massachusettsin yleissairaalassa Charlestownissa käyttivät 5xFAD-hiirimallia tutkiakseen pitkäaikaista ideaa, joka syntyi eräänä perjantai-iltapäivänä vuonna 2008, kun osaston perinteinen ”kaljatunti” – joka tunnetaan henkilökunnan ja opiskelijoiden keskuudessa myös nimellä ”asenteen sopeuttamisen tunti” – oli meneillään.
Tanzi oli etsinyt Alzheimerin taudin riskigeenejä joistakin uusista ihmisen genomitiedoista ja oli hämmentynyt nähdessään esiin putkahtavan geenin CD33:lle, joka on synnynnäisessä immuunijärjestelmässä laajalti ilmentyvä proteiini. Hän meni naapuriin kysymään ystävältään ja kollegaltaan Rob Moirilta, mitä mieltä tämä oli oudosta ajatuksesta, että synnynnäinen immuunijärjestelmä voisi tuoda esiin Alzheimer-geeniehdokkaan.
Neurotieteilijä Moir oli kiireinen kartoittaessaan, mitä uutta yleisessä biotieteiden kirjallisuudessa oli, ja hän oli törmännyt artikkeliin, joka käsitteli antimikrobisia peptidejä, joita esiintyy monissa synnynnäisen immuniteetin reiteissä. ”Kaveri, katso tätä”, hän huusi Tanzille. Hänen tietokoneensa näytti taulukon, jossa kuvattiin peptidejä, jotka olivat kaikki samanpituisia kuin amyloidi-β ja joilla oli joitakin samanlaisia ominaisuuksia. ”Luuletko, että amyloidi-β voisi olla antimikrobinen peptidi?” hän kysyi. Tanzi ei epäröinyt. ”Testataan sitä!”
Moir juoksi ajatuksen mukana. ”Hän oli kuin koira tossun kanssa, hän ei päästänyt irti”, Tanzi muistelee.
Tässä vaiheessa kukaan ei ollut juurikaan miettinyt, voisiko amyloidi-β:llä olla jokin erityinen tehtävä, vaikka se on hyvin konservoitunut eri lajeissa – vahva indikaattori biologisesta hyödyllisyydestä. Sekvenssi on vähintään 400 miljoonaa vuotta vanha, ja sitä esiintyy noin kahdessa kolmasosassa kaikista selkärankaisista. Ehkä se oli muutakin kuin pelkkä pahis, he spekuloivat. Ehkä sillä oli hyväntekijän tehtävä: se vangitsi aivoihin päässeet mikrobit ja esti niitä aiheuttamasta sairauksia. Tämä järjestelmä saattaa mennä pieleen, kun aivot ikääntyvät ja menettävät kykynsä poistaa amyloidit tehokkaasti.
Tanzi, joka oli opiskellut pääaineenaan mikrobiologiaa, pyysi jatko-opiskelija Stephanie Sosciaa tutkimaan nopeasti, voisiko amyloidi-β tappaa koeputkessa kahdeksan tavallista tauteja aiheuttavaa mikro-organismia, mukaan lukien Streptococcus pneumoniae ja Escherichia coli. Hän havaitsi, että se pystyi siihen – ainakin yhtä tehokkaasti kuin tunnetut antimikrobiset peptidit.
Tämä tosiasia julkaistiin lehdistössä5 vuonna 2010, ja seuraavina vuosina Moir johti sarjaa perusteellisempia kokeita, joissa tutkittiin sitä, mitä he nyt kutsuivat antimikrobiseksi suojahypoteesikseen. He ruiskuttivat Salmonella typhimurium -bakteeria suoraan plakkia muodostavien 5xFAD-hiirten aivoihin ja havaitsivat, että ne selviytyivät pidempään kuin ei-transgeeniset, plakkia tuottamattomat hiiret. He löysivät samankaltaisia tuloksia sukkulamatoilla käyttäen patogeenistä Candida albicans -sientä. Molemmissa tapauksissa amyloidit muodostivat tahmeita verkkoja, jotka nielaisivat ja riisuivat patogeenit aseista6 (ks. ”Miten mikrobit voivat kylvää plakkeja”).
Lähteet: Lähteet: Ref. 9; Nature 559, S4-S7 (2018).
Sitten työryhmä käänsi huomionsa herpesviruksiin, jotka olivat nousseet ihmisen patogeeneiksi, jotka yhdistetään eniten Alzheimerin tautiin. He ruiskuttivat HSV1:tä nuorten 5xFAD-hiirten ja normaalien hiirten aivoihin. Kolmen viikon kuluessa siirtogeenisten hiirten aivoissa oli amyloidiplakkeja. Kun tutkimusryhmä toisti kokeen tappavalla HSV1-annoksella, siirtogeeniset hiiret elivät pidempään kuin kontrollihiiret – ja plakit ilmestyivät niiden aivoihin huomattavan nopeasti kahden päivän kuluessa7. ”Se oli hämmästyttävää”, Tanzi sanoo.
HSV1 on niin laajalle levinnyt, että reilusti yli puolet maailman ihmisistä kantaa sitä elimistössään. Moir halusi kuitenkin testata myös HHV-6:n vaikutuksia, jota esiintyy jopa 10 prosentissa terveistä aivoista – tosin usein pieninä pitoisuuksina ja tuntemattomin vaikutuksin. Hiiret ovat vastustuskykyisiä HHV-6-infektiolle, joten Moirin työryhmä tutki viruksen vaikutuksia ihmisen hermosolujen 3D-viljelmässä, joka mallintaa joitakin Alzheimerin taudin piirteitä. Normaalisti tämä miniaivojen organoidi alkaa kerryttää amyloidiplakkeja ja tau-kudoksia kuuden viikon viljelyn jälkeen. Mutta kuten tutkijat olivat nähneet hiirillä, plakkeja ilmestyi vain kaksi päivää sen jälkeen, kun he olivat lisänneet viruksen7.
Moir ja Tanzi jatkoivat tutkimalla herpesvirusten vaikutusta tau-solukkojen muodostumiseen organoideissa ja sitä, voisivatko solukkojen muodostuminen estää virusten leviämisen alas neuroneihin. Moir kuoli joulukuussa 2019 lyhyen sairauden jälkeen, mutta Tanzi sanoo, että hänen ryhmänsä jatkaa edelleen tätä linjaa.
Tämänhetkisten proof-of-concept-kokeidensa tulos on hänen mukaansa se, että ”jos teet amyloidi-β:tä, selviät infektiosta paremmin”. Mutta hän myöntää, että varsinainen todiste – nähdä infektion laukaisevan amyloidikaskadin aiheuttavan sairauden – on vielä kaukana. ”Emme ole vielä nähneet savuavaa asetta”. Kukaan ei myöskään vielä tiedä, käytetäänkö amyloidi-β:n antimikrobisia ominaisuuksia osana normaalia fysiologista prosessia ihmisillä, hän sanoo, tai kuinka merkittäviä ne olisivat aivojen puolustusmekanismien yleisessä paletissa. Infektio voisi olla yksi tapa sytyttää tulitikku, joka johtaa Alzheimerin taudin syttymiseen, aivan kuten harvinaiset geneettiset mutaatiot tekevät.
Tietoisena siitä, että se, mikä sytyttää tulitikun taudin puhjetessa, ei välttämättä ole enää olemassa, kun henkilö kuolee, Tanzin laboratoriossa kehitetään tekniikoita, joilla voidaan eristää ja analysoida yksittäisiä plakkeja sen selvittämiseksi, onko niiden sisällä jäämiä mikrobeista. Se on eräänlainen arkeologinen kaivaustyö, hän sanoo.
Tukevia tutkimuksia
Tanzin työtä ei ole vielä toistettu riippumattomasti, mutta muut kokeet ovat antaneet aihetukea antimikrobisen suojan hypoteesille. Esimerkiksi Etelä-San Franciscossa, Kaliforniassa sijaitsevan biotekniikkayritys Genentechin tutkijat osoittivat, että mutaatio geenissä nimeltä PILRA, joka ilmentyy erilaisissa immuunisoluissa, on yhteydessä pienempään Alzheimerin taudin riskiin8. Geeni tuottaa proteiinia, joka auttaa herpes- ja muita viruksia pääsemään hermosoluihin, ja tutkijoiden mukaan mutaatio saattaa estää tämän pääsyn.
Ja mikä kiehtovinta, New Yorkissa sijaitsevan Memorial Sloan Kettering Cancer Centerin kemiallisten biologien Yue-Ming Lin laboratoriossa vuonna 2020 julkaistussa artikkelissa9 esitellään mekanismi, joka saattaa yhdistää neuroinflammaation amyloidi-β:n tuotantoon. Iin tutkimusryhmä havaitsi, että IFITM3-niminen proteiini käynnistyy, kun virukset pääsevät aivoihin. Proteiini sitoutuu yhteen amyloidia tuottavista entsyymeistä, γ-sekretaasiin, ja lisää amyloidin tuotantoa.
Li tutkimusryhmineen tutki aivopankkien näytteitä ja havaitsi, että IFITM3-geenin ilmentyminen lisääntyi iän myötä. Se oli myös korkeampi Alzheimerin tautia sairastavien aivoissa kuin kontrollihenkilöiden aivoissa. Lisäksi he havaitsivat viljellyillä aivosoluilla tehdyissä kokeissa, että tulehdusta edistävä molekyyli, sytokiini nimeltä interferoni, lisäsi sekä IFITM3:n että amyloidi-β:n tasoja (myös ihmisten aivonäytteistä löytyi enemmän interferonia siellä, missä IFITM3:a löytyi). Tämä kaikki viittaa heidän mukaansa siihen, että proteiini voisi toimia välittäjänä tulehduksen ja amyloidin muodostumisprosessin välillä.
Li tutkii nyt, voisiko IFITM3:sta tulla biomarkkeri, joka auttaisi päättämään, mitkä potilaat voitaisiin ottaa mukaan kliinisiin tutkimuksiin, joissa tutkitaan tulehdusta ehkäiseviä hoitoja tai γ-sekretaasiin kohdistuvia lääkkeitä. Hän tutkii myös, voisiko proteiinista tulla käyttökelpoinen kohde lääkekehitykselle.
Tulokset ovat de Strooperin mukaan ”suuri edistysaskel”, koska ne paljastavat sellaisen kaskadin, joka on ominaista monille monimutkaisille sairauksille, kuten syövälle. Prosessi ”voi käynnistyä joko mutaatioista, jotka aiheuttavat perinnöllistä Alzheimerin tautia ja jotka johtavat amyloidin lisääntymiseen, mikä lisää tulehdusta, tai infektiosta, joka johtaa tulehdukseen, joka lisää amyloidipeptidien ylituotantoa”, hän sanoo.
Jos tämä pitää paikkansa, sillä olisi merkittäviä vaikutuksia Alzheimerin taudin hoitoon, koska amyloidi-β:n tuotannon estäminen saattaisi merkitä sitä, että infektiot olisivat yhtäkkiä suurempi uhka aivoille. ”Mutta tämä on täysin spekulatiivista, ja riippuu siitä, miten tärkeäksi amyloidi-β saattaa osoittautua aivojen globaalissa puolustuslinjassa.”
Jotkut tutkijat suhtautuvat edelleen epäilevästi siihen, että infektioilla olisi merkittävä rooli Alzheimerin taudissa. Lontoon University Collegessa työskentelevä neurotieteilijä John Hardy, joka jakoi vuoden 2018 Brain Prize -palkinnon de Strooperin ja muiden kanssa Alzheimerin tautia koskevasta työstä, sanoo, että hän ”lyö vetoa 5 punnan mutta ei 500 punnan puolesta” siitä, että antimikrobinen suojateoria pitää paikkansa. ”En kuitenkaan usko, että se on todistettavissa, enkä usko, että Alzheimerin taudista on enää paljon muuta selitettävää kuin genetiikka”, hän sanoo. Neurotieteilijä Tara Spires-Jones Edinburghin yliopistosta Yhdistyneessä kuningaskunnassa sanoo, että vaikka tähänastiset tiedot mahdollistavat sen mahdollisuuden, että infektio siementää joitakin Alzheimerin tautitapauksia aiheuttamalla tulehduksen, myös normaali ikääntymisprosessi voisi olla selitys. Hän huomauttaa, että ikääntyminen on suurin riskitekijä Alzheimerin taudin kehittymiselle. ”Henkilökohtaisen mielipiteeni mukaan ikääntymisen mukanaan tuoma yleinen tulehdus aivoissa on todennäköisempi syy.”
Oikeilla malleilla osa tutkijoista on kuitenkin sitä mieltä, että infektioteoria voisi olla todistettavissa, vaikka saattaisikin olla vaikeaa osoittaa, mikä osa Alzheimer-tapauksista sai alkunsa mikrobista. Jacobson on innostunut uusista mahdollisuuksista ja toivoo kehittävänsä marmosettimallin infektioteorian testaamiseksi, koska tämä pieni kädellinen jäljittelee Alzheimerin taudin patologiaa ihmisessä tarkemmin kuin muut mallit. Tanzi aikoo käyttää hiirtä, jonka amyloidigeenit on vaihdettu ihmisen vastaaviin ja joka näin ollen ilmentää ihmisen amyloidi-β:tä normaalilla fysiologisella tasolla. Toinen tärkeä askel on se, että riippumattomat laboratoriot toistavat olemassa olevat havainnot.
Norinsin palkinnon osalta 40 hakijaa on tähän mennessä toimittanut töitä siinä toivossa, että he voisivat voittaa rahapalkinnon maaliskuussa, kun kilpailun tulokset julkistetaan. Norins on tietoinen tehtävän valtavuudesta. Todiste siitä, että jokin bakteeri aiheuttaa Alzheimerin taudin, on hänen mukaansa ”vaikein mahdollinen todiste”.
Hän sanoo, että se on ”vaikein todiste”.