Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) on pylväskromatografian muoto, jossa näyteseos tai analyytti pumpataan liuottimessa (liikkuvassa faasissa) olevaan näyteseokseen (liikkuvaan faasiin) korkeassa paineessa kolonnin läpi, jossa on kromatografinen pakkausmateriaali (stationäärifaasi). Näytettä kuljettaa liikkuva kantokaasuvirta, joka on heliumia tai typpeä. HPLC:llä voidaan erottaa ja tunnistaa yhdisteitä, joita on missä tahansa näytteessä, joka voi liueta nesteeseen, niinkin pieninä pitoisuuksina kuin triljoonasosina. Tämän monipuolisuuden ansiosta HPLC:tä käytetään monissa teollisissa ja tieteellisissä sovelluksissa, kuten lääke-, ympäristö-, rikosteknisissä ja kemiallisissa sovelluksissa.
Näytteen retentioaika vaihtelee riippuen stationäärifaasin, analysoitavien molekyylien ja käytetyn liuottimen tai liuottimien välisestä vuorovaikutuksesta. Kun näyte kulkee kolonnin läpi, se vuorovaikuttaa kahden faasin välillä eri nopeudella, mikä johtuu pääasiassa analyyttien erilaisista polariteeteista. Analyytit, joilla on vähiten vuorovaikutusta stationäärifaasin kanssa tai eniten vuorovaikutusta liikkuvan faasin kanssa, poistuvat kolonnista nopeammin.
Instrumentointi:
HPLC-järjestelmän pääkomponentteihin kuuluvat liuotinsäiliö tai useampi säiliö, korkeapainepumppu, kolonni, injektorijärjestelmä ja detektori.
Tunnistusraja |
Kaasusuositus |
Säätimen suositus |
| Purge-kaasu | ||
| ≤ 1 ppm | HiQ Helium 5.0 | BASELINE C106 series |
Säiliössä on liuotin, jota kutsutaan liikkuvaksi faasiksi, koska se liikkuu. Järjestelmässä on yleensä vähintään kaksi säiliötä, joista kumpaankin mahtuu enintään 1000 cc liuotinta, ja ne on yleensä varustettu kaasudiffuusorilla, jonka läpi voidaan kuplia heliumia. Pumppua käytetään liikkuvan faasin tietyn virtauksen tuottamiseen. Vaikka näytteiden injektointi käsin on edelleen mahdollista, useimmat HPLC-laitteet ovat nykyään täysin automatisoituja ja tietokoneen ohjaamia. Injektori eli automaattinen näytteenottolaite syöttää liuottimen faasivirtaan, joka kuljettaa näytteen korkeapaineiseen (jopa 400 baarin) kolonniin, joka sisältää erottelun aikaansaamiseksi tarvittavaa erityistä pakkausmateriaalia. Pakkausmateriaalia kutsutaan pysyväksi faasiksi, koska kolonnin laitteisto pitää sen paikallaan.
Detektoria tarvitaan, jotta erotetut yhdisteiden kaistat voidaan nähdä, kun ne eluoituvat korkeapainekolonnista. Tieto lähetetään detektorista tietokoneeseen, joka tuottaa kromatogrammin. Liikkuva faasi poistuu detektorista ja joko lähetetään jätteeseen tai kerätään talteen halutulla tavalla.
Helium sparging on tehokas menetelmä kaasunpoistoon liikkuvasta faasista, jotta vältetään liuenneen ilman aiheuttamat epävakaat perusviivat. Typpeä käytetään sumutuskaasuna haihtuvassa valonsirontailmaisimessa (Evaporative Light Scattering Detector, ELSD), jossa liuotin haihtuu näytteestä jättäen mitattavan sumun.
Korkean suorituskyvyn nestekromatografia – Muut HPLC-tyypit
Ultranopean suorituskyvyn nestekromatografia (uHPLC):
Vaikka tavallisessa HPLC:ssä käytetään tyypillisesti kolonnin partikkeleita, joiden koko on 3-5 µm, ja noin 400 baarin paineita, uHPLC:ssä käytetään erikoissuunniteltuja kolonneja, joiden partikkelit ovat kooltaan jopa 1,7 µm, ja joiden käyttöpaine on yli 1000 baaria. uHPLC:n tärkein etu on nopeus. Nämä järjestelmät ovat nopeampia, herkempiä ja käyttävät pienempiä määriä orgaanisia liuottimia kuin tavalliset HPLC-järjestelmät, mikä mahdollistaa useampien näytteiden ajamisen lyhyemmässä ajassa. Jos järjestelmiä kuitenkin käytetään tyypillisesti yli 800 baarin paineissa, kolonnit vanhenevat tai hajoavat nopeammin. Uutta teknologiaa kehitetään uHPLC-yksiköihin, joissa käytetään 1 µm:n kokoisia kolonnipartikkeleita ja jopa 6 800 barin painepotentiaalia.
uHPLC tunnetaan myös nimellä UPLCTM, joka on Waters Corporationin tavaramerkki.
Nopea proteiininestekromatografia (FPLC):
FPLC on korkean suorituskyvyn nestekromatografian kaltainen järjestelmä, jota käytetään proteiinien ja muiden biomolekyylien erottamiseen tai puhdistamiseen monimutkaisista seoksista. Tärkein ero FPLC:n ja HPLC:n välillä on vakiotyöpaine. FPLC-kolonnia voidaan käyttää vain 3-5 MPa:n maksimipaineeseen asti. Jos HPLC:n painetta voidaan rajoittaa, lähes kaikkia FPLC-kolonneja voidaan käyttää myös HPLC-järjestelmässä.